银鲫Greb1的克隆、表达及功能研究

李石竹 刘 威 李 志 周 莉 卢建国 桂建芳

(1. 中山大学海洋科学学院, 珠海 519082; 2. 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072)

垂体是鱼类重要的内分泌器官, 它响应来自下丘脑的信号分子, 产生激素并分泌到血液中, 调控鱼类生长、发育、生殖、代谢和盐水平衡等重要生物学过程[1]。近年来, 随着垂体细胞发育和激素调控相关的基因相继被鉴定, 垂体的起源和发生过程被初步阐明[2—4]。鱼类垂体发育可追踪到体节期(约受精后10h); 在受精后24h, 腺垂体初步分化, 通过检测垂体标记基因泌乳素(Prolactin,prl)的表达,可追踪位于下丘脑腹部吻端和口道背部的腺垂体;在受精后42—48h, 通过检测标记基因促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone,tshβ)的表达可以示踪腺垂体的促甲状腺激素细胞; 在受精后60h, 腺垂体细胞进一步内化, 镶嵌到与下丘脑相连的脑软骨缝隙中[5]。研究表明, 垂体的形成和发育受到一系列信号通路的调控, 例如Hedgehog(Hh)[6]、Nodal、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth factor,FGF)[7]和骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)等多个信号通路的信号调控[8]。

雌激素应答基因Greb1最早发现用于雌二醇(17β-Estradiol, E2)处理后的人类乳腺癌细胞系(MCF7)的差减文库中。在E2诱导的MCF7细胞中,Greb1是上调倍数最大的一个应答基因[9]。在哺乳动物中,Greb1作为一个潜在的抗癌药物作用靶点而被广泛地研究[10—12]。在蛙类胚胎发育过程中,Greb1高表达于中枢神经系统, 表明它可能参与早期神经发育[13]。在斑马鱼(Danio rerio)中, 研究表明Greb1受到Nodal和Hh信号通路的双重调控[6,14]。最近, 我们从斑马鱼中克隆到了Greb1基因, 编码1840个氨基酸, 敲除Greb1会导致斑马鱼死亡率升高、垂体发育异常以及生长缺陷。这表明Greb1在斑马鱼垂体细胞发育和生长调控过程中发挥作用[15]。然而, 在其他鱼类中,Greb1的功能尚不清楚。

银鲫(Carassius gibelio)是我国重要的淡水养殖鱼类之一, 在其天然种群中存在着丰富的、遗传异质的克隆系[16—18]。因其特殊的多重生殖方式和性别决定机制, 银鲫已成为研究发育遗传的独特生物学模型[19,20]。近年来, 关于银鲫生殖发育相关的基因被克隆和鉴定[21—24], 其性别调控机制也初步得到阐明[25—30]。然而, 银鲫生长调控相关基因及其调控机制尚不清楚。垂体作为内分泌调控的枢纽, 在生长发育中发挥关键作用。在前期工作中, 我们从银鲫垂体cDNA文库中鉴定到Greb1基因, 编码255个氨基酸。银鲫这个截短的Greb1的表达和功能与斑马鱼Greb1是否存在不同尚不清楚。因此, 本研究对银鲫垂体高表达基因Greb1的组织和胚胎时空表达以及功能进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

银鲫饲养于中国科学院水生生物研究所关桥实验基地。分离2龄银鲫的多个组织, 包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、肠、皮肤、精巢、卵巢、端脑、中脑、小脑、后脑、垂体和下丘脑, 用于RNA提取和定量PCR分析。

在繁殖季节, 对成熟的银鲫雌性个体腹腔注射促黄体生成素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素的混合物进行人工催产。在注射激素后不同时间, 各取3条雌鱼的垂体用来提取RNA。取不同发育时期胚胎, 包括囊胚期、50%外包期、75%外包、尾芽期、4体节期、15体节期、受精后24、30、36和48h的胚胎用于RNA提取和胚胎整体原位杂交。

1.2 RNA提取、单链cDNA和SMART cDNA文库建立

取30颗银鲫胚胎或者50 mg组织进行总RNA提取, 方法按照Promega SV Total RNA Isolation Kit的操作手册。RNA质量通过琼脂糖凝胶电泳和Nano-Drop 2000检测来确定。以1 μg RNA作为模板反转录成单链cDNA, 方法根据First-strand cDNA Reverse Transcription Kit (Invitrogen)的操作手册。提取2龄银鲫的垂体总RNA, 取1 μg RNA用于构建SMART cDNA文库(Clonetech), 文库构建和后续RACE-PCR方法详见试剂盒说明[31]。

1.3 生物信息学分析

利用MEGA 6软件采用最大相似性法(Maximum-likelihood method), 进行1000次自展重复, 构建Greb1氨基酸系统发生树序列。使用DNAMAN 6拼接Greb1 cDNA序列, 并预测其编码的氨基酸序列及其分子量大小。

1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR采用SYBR green qRT-PCR mix (Bio Rad)配套的试剂盒耗材, 在BioRad荧光定量PCR仪上完成。PCR程序如下： 94℃预变性4min, 95℃变性15s, 58℃退火30s, 72℃延伸15s, 40个循环(引物见表 1)。Greb1的相对表达量采用2-ΔΔCt方法, 银鲫β-actin作为内参基因。

1.5 地高辛(Digoxin, DIG)标记反义RNA探针合成和胚胎整体原位杂交

根据Greb1、prl、gthα、tshβ和pomca等基因的cDNA序列设计引物, 在反向引物的5′端添加T7启动子核心序列, 通过PCR扩增得到500—700个碱基大小的DNA片段, 以此DNA为模板, 合成DIG标记的RNA探针, 方法见DIG labelling RNA T7 Kit (Roche)操作手册(引物见表 1)。胚胎原位杂交的具体操作步骤按照Thisse等[32]和Li等[15]描述的方法进行。

1.6 Morpholino的合成和注射

CgGreb1翻译抑制morpholino (CgGreb1 MO)和5个碱基错配的对照morpholino (Con MO)在genetools上设计和合成(http：//www.gene-tools.com/)。MO序列为：CgGreb1MO： (5′-GTCCTGTATATG AATTCCCCATGAC-3′), Con MO： (5′-GTCGTCT ATATCAATTCCCGATCAC-3′)。MO稀释2 mmol/L,并保存在-80℃。在1细胞期银鲫胚胎中, 以4000 pg/颗的剂量分别注射CgGreb1 MO和对照MO, 在48 hpf后, 收集胚胎, 检测垂体细胞相关基因的表达[15]。

1.7 体外检测CgGreb1 MO的有效性和特异性

将Cggreb1完整的开放阅读框(包含CgGreb1 MO识别的位点)插入到pEGFP-N3载体中, 即Cggreb1-GFP质粒。将Cggreb1-GFP质粒分别与Cg-Greb1 MO和Con MO共转染到293T细胞。在转染24h后, 在同等荧光强度、曝光时间和放大倍数下,对转染了CgGreb1 MO和Con MO的293T细胞中GFP阳性细胞的比例以及GFP的强弱进行统计。

2 结果

2.1 CgGreb1的序列分析

通过RACE-PCR克隆获得银鲫Greb1全长cDNA (GenBank登录号： MN011570) 954 bp, 其中包含115 bp 5′非编码区(Untranslated region, UTR),765 bp开放阅读框和74 bp 3′UTR。CgGreb1编码255个氨基酸, 分子量为28.05 kD。从NCBI数据库中检索其他物种Greb1基因, 大多数脊椎动物的Greb1蛋白存在多个蛋白变体, 由386—1988个氨基酸组成。人类有3个Greb1变体(Greb1a、Greb1b和Greb1c), 分别编码1949、449和386个氨基酸。虽然人类的3个Greb1蛋白变体长度差异很大, 但是它们的N端氨基酸序列非常保守[9]。接下来, 我们对CgGreb1和其他脊椎动物的Greb1蛋白的序列进行比对分析, 其中CgGreb1位于其他脊椎动物的N端保守区域, 它是脊椎动物Greb1蛋白序列最为保守的一段氨基酸区域。并且CgGreb1与其他Greb1对应氨基酸区域具有较高的一致性,CgGreb1与鲤科鱼类鲤(Cyprinus carpio)和斑马鱼Greb1对应氨基酸的一致性高达为91%和90%, 与其他硬骨鱼如青鳉(Oryzias latipes)、大黄鱼(Larimichthys crocea)和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)等的Greb1对应氨基酸的一致性为68%到76%, 与哺乳动物和蛙类等的Greb1对应氨基酸的一致性也超过60%。分子进化树分析表明, 脊椎动物Greb1主要分为两支, 银鲫、斑马鱼、鲤、墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)、青鳉、大黄鱼和红鳍东方鲀等鱼类的Greb1聚为一支, 人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis lupus familiaris)、牛(Bos taurus)、爪蟾(Xenopus tropicalis)、鸡(Gallus gallus)的Greb1聚为另一支。其中CgGreb1与鲤Greb1的亲缘关系最近(图 1)。

表 1 引物序列Tab. 1 Primers information

2.2 CgGreb1在成体组织中的分布

图 1 银鲫Greb1蛋白和其他物种中的同源蛋白的系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of Carassius gibelio Greb1 and other vertebrate homologuesThe GenBank IDs for Greb1 proteins used for this study are as follows： Cyprinus carpio, KTF99976.1; Danio rerio, XP_00 5158874.1; Astyanax mexicanus, XP_015458997.2; Larimichthys crocea, XP_019117930.1; Oryzias latipes, XP_011490902.1; Takifugu rubripes, XP_011616889.1; Xenopus tropicalis, XP_0128 18910.1; Gallus gallus, XP_004935823.1; Canis lupus familiaris,XP_022260164.1; Bos taurus, NP_001192560.1; Mus musculus isoform 1, NP_056579.2; Mus musculus isoform 2, NP_00123 9000.1; Rattus norvegicus, XP_008762860.1; Homo sapiens isoform a, NP_055483.2; Homo sapiens isoform b, NP_149081.1;Homo sapiens isoform c, NP_683701.2

我们利用qRT-PCR检测了CgGreb1 mRNA在组织中的表达分布。如图 2A所示,CgGreb1主要在垂体、肝脏、性腺和各种脑组织中高表达, 而在心脏、脾脏、肾脏、肌肉和皮肤等组织中几乎检测不到, 其中CgGreb1在垂体中的表达量最高。接下来, 我们检测了CgGreb1在注射促黄体生成素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素后的雌鱼垂体中的动态表达。如图 2B所示,CgGreb1的表达在注射后2h开始上调, 并逐渐升高, 在注射后6h达到峰值, 随后CgGreb1的表达轻微下降, 但是在注射后10h仍然维持较高的表达水平。

2.3 CgGreb1在胚胎中的时空表达图式

图 2 银鲫Greb1在成鱼组织(A)和注射促黄体生成素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素后的雌鱼垂体(B)中的表达模式Fig. 2 Relative Expression of Carassius gibelio Greb1 in adult tissues (A) and the female pituitaries by intraperitoneal injection of luteinizing hormone-releasing hormones-A2 and human chorionic gonadotropin (B)heart. 心脏; liver. 肝脏; spleen. 脾脏; kidney. 肾脏; muscle. 肌肉;gut. 肠道; skin. 皮肤; testis. 精巢; ovary. 卵巢; telencephalon. 端脑; mesencephalon. 中脑; parencephalon. 小脑; metencephalon.后脑; pituitary. 垂体; hypothalamus. 下丘脑

我们进一步研究了CgGreb1在银鲫胚胎发育过程中的时空表达。qRT-PCR结果表明, 在囊胚期之前的胚胎中,CgGreb1 mRNA不表达; 在50%外包期,CgGreb1有微弱的表达, 其表达量随着胚胎发育进行逐渐升高, 在受精后24h达到峰值; 从受精后30h开始,CgGreb1的表达量开始减少, 在受精后48h几乎检测不到(图 3)。整体原位杂交结果显示,在囊胚期, 没有检测到CgGreb1信号(图 4A); 在50%外包期,CgGreb1特异表达于胚层的边缘(图4B); 在尾芽期,CgGreb1表达逐渐增强并位于尾芽(图 4C); 在4体节期,CgGreb1的表达进一步变强并且开始在脑部出现(图 4D); 随着中枢神经系统发育, 在15体节时,CgGreb1在尾部的表达有轻微减弱, 但是在脑部的表达逐渐增多且覆盖区域变广,在脑原基、眼基、脊索等中枢神经系统均有较高表达(图 4E); 在受精后24h,CgGreb1的表达进一步增强并主要表达于间脑、中脑、后脑、眼睛、脊索等中枢神经系统(图 4F); 在受精后30h,CgGreb1在脑部的表达有微弱的增多, 但在尾部的表达急剧减少(图 4G); 在受精后36h,CgGreb1在脑部的表达也明显减少(图 4H); 在受精后48h,CgGreb1的表达基本完全消失(图 4I)。

2.4 敲降CgGreb1导致垂体细胞发育异常

接下来, 我们合成抑制CgGreb1翻译的MO并检测了其有效性和特异性。如图 5所示, 相比于Con MO和Cggreb1-GFP质粒共转染的293T细胞,CgGreb1 MO和Cggreb1-GFP质粒共转染的293T细胞中GFP阳性细胞的比例明显减少, GFP的强度明显减弱, 说明CgGreb1 MO能够有效抑制CgGreb1翻译。随后我们将CgGreb1 MO注射到银鲫胚胎中。如图 6所示, 与注射对照Con MO的银鲫胚胎相比,在注射CgGreb1 Con MO银鲫胚胎中,tshβ、prl和gthα分别标记的促甲状腺激素细胞, 泌乳素细胞和促性腺激素细胞的数量明显减少, 而pomca标记的促阿黑皮素原细胞的数量没有明显变化。这表明CgGreb1与银鲫早期垂体细胞的形成相关。

图 3 银鲫Greb1在胚胎发育时期的表达分布Fig. 3 The relative expression of Carassius gibelio Greb1 during early embryogenesisBlastula. 囊胚期; 50% epiboly. 50%外包期; 75% epiboly. 75%外包期; bud. 尾芽期; 4 s. 4体节期; 15 s. 15体节期; 24 hpf. 受精后24h; 30 hpf. 受精后20h; 36 hpf. 受精后36h; 48 hpf. 受精后48h

3 讨论

垂体是神经内分泌的重要功能器官, 在鱼类生长、生殖、营养代谢和盐水平衡等重要过程中发挥关键作用[33]。水产养殖是人类重要的动物蛋白来源。银鲫是我国重要的淡水经济鱼类[34]。阐明银鲫生长调控机制对于银鲫新品种的优良选育具有重要意义。在本文中, 我们鉴定了一个较短的银鲫Greb1基因。与斑马鱼Greb1的表达和功能类似,银鲫Greb1在垂体中高表达, 并参与调控银鲫垂体早期发育。

与其他脊椎动物Greb1蛋白相比,CgGreb1的氨基酸序列较短, 仅为其他脊椎动物Greb1蛋白N端的一部分, 但是CgGreb1 mRNA有一个明显的加尾信号和poly A序列, 表明RACE得到的CgGreb1是一个完整的mRNA。CgGreb1与其他鱼类Greb1蛋白存在高度一致性, 证明Greb1在进化过程中十分保守,这也预示着银鲫Greb1在功能上的保守性。

在哺乳动物中, 雌激素在许多生物学过程中发挥重要功能。雌激素代谢异常会导致多种疾病甚至癌症的发生, 例如乳腺癌、宫颈癌和卵巢瘤等[35]。Greb1是一个重要的雌激素应答基因, 在雌激素信号通路中发挥重要作用[36,37]。研究表明, 在体外,抑制Greb1的表达能够明显抑制癌细胞的增殖、迁移和扩散; 在体内, 抑制Greb1能够明显抑制癌细胞的生长[12]。在银鲫中,CgGreb1 mRNA主要在肝脏、脑、下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG轴)中表达(图 5), 这与斑马鱼Greb1的组织表达一致[15]。HPG轴是鱼类神经生殖内分泌的主要调控枢纽, 在鱼类配子发育、成熟和产卵等过程中发挥关键作用。雌激素作为一个重要的HPG轴终端因子, 高表达的雌激素会与下丘脑中的雌激素受体结合, 来负反馈调节抑制促性腺激素释放激素(GnRH), 从而降低下丘脑表达的促性腺激素, 例如： 促卵泡激素(FSHβ)和黄体激素(LHβ),最终抑制性腺中雌激素的表达来维持雌激素的平衡[38]。然而研究表明, 在斑马鱼、草鱼、日本鳗鲡和金鱼中, 雌激素能够与垂体中雌激素受体结合,促进垂体中FSHβ和LHβ的表达[38]。在斑马鱼中,Greb1敲除的成熟斑马鱼雌鱼初始排卵能力正常,但是在产卵后1—2个月,Greb1突变体血清中的FSHβ和LHβ明显减少, 导致卵子的数量和质量明显减弱, 甚至无法排卵(未发表数据)。这表明, 在斑马鱼中, 雌激素可能通过Greb1正调控HPG信号通路中的FSHβ和LHβ表达。在人工注射促黄体生成素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素, 促进银鲫卵母细胞成熟和排卵的过程中,CgGreb1在垂体中的表达逐渐升高并维持较高的表达水平, 预示着CgGreb1可能通过HPG轴参与调控银鲫卵母细胞成熟和排卵过程。垂体和肝脏分别是鱼类激素分泌和应答的重要器官, 与个体的生长、代谢和生殖发育密切关联,CgGreb1在垂体和肝脏中的表达水平最高, 预示着它很可能参与调控银鲫的激素分泌和应答过程。

图 4 银鲫Greb1在胚胎中的时空定位Fig. 4 Spatial and temporal location of CgGreb1 during embryogenesis

图 5 体外检测CgGreb1 MO有效性和特异性Fig. 5 Analysis of CgGreb1 MO effectiveness and specificity in vitro

图 6 胚胎整体原位杂交检测注射对照和CgGreb1 morpholino的受精后48h的银鲫胚胎中, 垂体标记基因的表达Fig. 6 WISH analyses of pituitary markers in control (con) or CgGreb1 (mo) morpholino gibel carp embryos at 48 hours post fertilization

在胚胎中, 银鲫和斑马鱼Greb1都在原肠期特异表达于胚层的边缘。在斑马鱼中, 我们的研究报道表明Greb1调控胚层的汇聚(Covergence)和延伸(Extension)运动, 敲除Greb1会导致斑马鱼胚胎发生汇聚和延伸障碍, 造成严重畸形[15]。然而, morpholino敲降Greb1的银鲫胚胎没有呈现明显的畸形, 这可能因为morpholino不能完全消除Greb1蛋白的翻译造成的。因此, 要验证银鲫Greb1是否也参与调控胚层的汇聚和延伸, 需更进一步的基因敲除,以及检测与汇聚和延伸相关的分子标记来验证。和斑马鱼Greb1类似, 在体节发生期,CgGreb1表达逐渐升高并开始在中枢神经系统高表达, 而在中枢神经系统形成后,CgGreb1迅速减少。在爪蟾胚胎发育过程中,XGreb1也在中枢神经系统中高表达：在15期,XGreb1表达于中后脑隔板(Mid-hind brain boundary); 在23期,XGreb1表达于中脑和后脑区域;在28期,XGreb1表达于嗅觉基板, 脊索和许多脑部区域[13]。结合CgGreb1在成鱼的中枢神经系统的高表达, 这表明CgGreb1极有可能在银鲫中枢神经系统的形成、发育和维持过程中发挥重要作用。

在银鲫中, 我们的研究结果表明敲降Greb1导致tshβ、prl和gthα阳性的垂体细胞数量出现明显减少, 而pomca阳性的细胞没有明显变化(图 6), 证明CgGreb1参与早期垂体的形成和分化。在斑马鱼中, 我们已经报道Greb1在垂体发育中的功能。在受精后24h的斑马鱼胚胎中, 敲除Greb1导致pit1和lim3阳性的垂体前体细胞出现一定的减少; 在受精后48h, 斑马鱼早期腺垂体细胞进一步发育和分化[38],敲除Greb1的胚胎中gh、tshβ、prl和gthα分别标记的生长激素细胞, 促甲状腺激素细胞, 泌乳素细胞和促性腺激素细胞均出现明显减少, 并且敲除Greb1导致斑马鱼幼苗的存活率明显降低; 在受精后10d,Greb1敲除斑马鱼幼苗的存活率为56%, 并且在受精后20d存活率进一步下降到31%。在受精后3个月,Greb1敲除的斑马鱼体重仅为正常斑马鱼的50%, 体长为81%, 出现明显的生长障碍。我们将CgGreb1敲降银鲫养大至一龄, 发现CgGreb1敲降的银鲫也出现了体重减轻的现象(未发表数据)。

在斑马鱼和银鲫胚胎中, WISH结果显示在垂体中未发现明显高表达的Greb1信号, 表明Greb1可能是通过信号网络的应答, 来影响垂体发育。但是Greb1调控鱼类垂体发育的分子机制尚需进一步阐明。研究表明,Greb1是Hedgehog (Hh)[6]下游应答基因。在斑马鱼中, 维持正常Hedgehog (Hh)信号通路对早期垂体的形成至关重要。通过突变体或者化学药物抑制剂阻断Hh信号通路, 会促使未分化的腺垂体原基细胞向晶状体细胞(Lens)分化, 导致垂体细胞减少, 从而干扰了正常的垂体发育[6]。

4 结论

在本研究中, 我们克隆得到银鲫Greb1的全长cDNA序列。利用qRT-PCR和WISH描述了Greb1在银鲫组织和胚胎中的时空表达图式, 发现其在胚胎发育和成体组织中均与中枢神经系统相关。并且利用基因敲降技术, 我们证明Greb1参与调控银鲫早期垂体发育和分化。因此, 我们推测Greb1与银鲫生长发育相关。此外,Greb1调控垂体发育的分子机制尚需进一步阐明。