嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼生长、消化性能和抗病力的影响

李军亮 杨奇慧 谭北平 董晓慧 迟淑艳 刘泓宇 章 双 张海涛

(1. 广东海洋大学水产学院, 水产动物营养与饲料实验室, 湛江 524088;2. 农业部南方水产与畜禽饲料重点实验室, 湛江 524074)

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)营养丰富、养殖成本低、销量好, 具有相当高的经济价值, 在我国华南沿海广泛养殖[1,2]。但近年来, 病害的频繁发生对斜带石斑鱼养殖业造成相当大的经济损失, 严重阻碍石斑鱼产业的发展[3—5]。因此, 寻找有效的病害防治措施, 已成为降低损失、提高石斑鱼养殖成功率的重要策略之一。益生菌是指在一定范围内可以通过抑制有害微生物生长, 促进养分的吸收, 刺激免疫系统来增进宿主健康的活体微生物制剂, 越来越多的研究者选择使用益生菌作为提高机体抗病力的重要措举措[6,7]。

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为革兰氏阳性菌, 在机体内释放乳酸和乙酸等抗菌物质,抑制有害菌生长, 调节肠道微生态平衡[8]; 调节机体免疫功能, 维持肠道正常内环境[9]; 增强抗毒抗病能力[8]。近年来嗜酸乳杆菌在水产动物应用上的研究颇多, Hoseinifar等[10]用含有嗜酸乳杆菌的饲料投喂黑剑鱼(Xiphophorus helleri), 可提高鱼的存活率、增重率、特定生长率; 何伟聪等[11]证实嗜酸乳杆菌可提高军曹鱼(Rachycentron canadum)的生长性能和消化酶活性; 赵倩等[12]在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)上的研究指出, 嗜酸乳杆菌可提高草鱼鱼种的生长性能及免疫力; 周晓波等[13]对罗非鱼(Oreochromisspp.)的研究表明, 添加乳酸菌可以促进罗非鱼生长, 提高其饲料利用率。乳酸杆菌以其对肠道强大的黏附作用及良好的耐酸性, 适宜在机体肠道内定植[14,15]。然而, 嗜酸乳杆菌在斜带石斑鱼上的应用研究比较少, 因此, 本实验通过在饲料中添加不同比例的嗜酸乳杆菌, 探究其对斜带石斑鱼幼鱼生长性能、消化酶活性、抗病力和相关酶mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 饲料配制

实验饲料以鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉和鱼油、玉米油、大豆卵磷脂分别作为配方中主要蛋白源和脂肪源, 实验饲料组成与营养水平见表 1, 分别添加(0、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%)嗜酸乳杆菌, 在加水搅拌过程中以菌液形式添加。饲料原料经粉碎后过60目筛, 准确称取各组份所需的添加量, 其中, 大宗原料先于V型混合机(VH-6, 江苏驰通)混合10min, 微量元素等通过逐级扩大法进行混合均匀, 然后以双螺杆挤条机(F-26华南理工大学, 广州)配制成直径为2 mm的饲料,风干后分装于-20℃冰箱保存备用。取各组饲料样品检测有效活菌数, 0.1%组为0.72×108cfu/g, 其他各组符合实验设计比例, 具体方法参照。

1.2 饲养管理及材料来源

养殖实验在广东湛江广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地0.5 m3的玻璃纤维钢桶中进行, 实验鱼苗来源于广东雷州如朝育苗场。鱼苗于室外水泥池暂养8d, 挑选初始质量(5.60±0.05) g的健康个体以每桶30尾分成8个处理组, 每个处理组设3个重复。每天饱食饲喂2次(8：00和 17：00), 根据天气、摄食和生长情况相应调整投喂量。实验期间每天换水, 换水量2/3, 不断充气使溶解氧达到饱和(7—8 mg/L), 水温为(30.5±0.8)℃, 盐度为29—31,pH 7.6—7.8, 氨氮低于0.02 mg/L, 养殖周期8周。

实验用嗜酸乳杆菌菌种来源于广东省微生物菌种保藏中心(GIM1.730), 采用MRS培养基进行复苏扩增培养, 培养方法参照说明书进行, 菌液浓度采用光电比浊法测定。攻毒用哈维弧菌(Vibrio harveyi, EcGY020401)菌种由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室提供。

1.3 样品采集与测定

实验结束样品采集前停喂24h, 用一次性无菌注射器(1 mL)于尾静脉采血, 立即离心(3500 r/min离心10min), 取上清液于1.5 mL的离心管中, 保存在-80℃超低温冰箱(Thermo electron corporation,美国)中备用。用无菌镊子及剪刀取8尾鱼的肝脏和肠道放于离心管中, 液氮速冻后于-80℃保存, 用于消化酶活的测定。再取8尾放于装有RNA later的离心管中, 放于-80℃超低温冰箱保存备用。哈维弧菌是水产养殖过程中主要的致病菌之一, 因此本实验采用哈维弧菌进行攻毒实验。通过预试验确定斜带石斑鱼的半致死浓度(LD50)为1.0×107cfu/mL (7d)。实验开始每个处理随机选取30尾鱼, 分为3个重复, 每个重复10尾, 以哈维弧菌(1.0×107cfu/mL)腹腔注射进行攻毒试验, 生理盐水作对照组, 观察记录7d每桶剩余鱼数量, 计算累计存活率。

表 1 实验饲料组成与营养水平(干物质%)Tab. 1 Composition and nutrient levels of the experiment diets(DM %)

计算公式：

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100×(末均重-初均重)/初均重;

特定生长率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100×(ln末均重-ln初均重)/实验天数;

饲料系数(Feed conversion ratio,FCR)=摄食量/(末重-初重);

蛋白质效率(Protein efficiency ratio,PER)=100×(末均重-初均重)/(摄食总量×饲料粗蛋白含量);

成活率(Survival,SR, %)=100×(实验结束时尾数/初始尾数)。

饲料和全鱼的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分的测定参考AOAC[16], 水分的检测采用105℃干燥恒重法; 粗蛋白的检测采用凯氏定氮法(CP,N×6.25, KjeltecTM 8400, 瑞典); 粗脂肪的检测采用索氏抽提法; 粗灰分的检测采用箱式马福炉550℃灼烧法。肝脏、肠道淀粉酶、蛋白酶活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定, 同时参考文献[17]测定方法, 具体操作严格按照各试剂盒说明书执行。

1.4 肝胰腺淀粉酶、蛋白酶mRNA表达量的测定

引物设计淀粉酶(AMY)、蛋白酶(TRY)引物设计参照文献[18—20], 引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成, 内参基因β-actin和目的基因AMY、TRY的引物序列见表 2。

总RNA提取及cDNA的合成采用TRIzol(宝生物, 大连)法提取鱼肝脏中的总RNA, 具体操作方法参照说明书和参考文献[21—24]。提取完成之后的总RNA用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳, 在凝胶成像仪上观察其完整性, 用Nano Drop 2000c (Thermo)定量检测RNAA260/A280, 比值在1.8—2.0的RNA样品保存于-80℃用于后续实验。

表 2 RT-PCR所用引物序列Tab. 2 Primers used for RT-PCR

采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒将提取到的总RNA进行反转录反应, 合成cDNA, 具体操作步骤严格按照试剂盒说明书及参照文献[20—24]等执行。

RT-PCR分析按照SYBR®Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(宝生物, 大连)试剂说明操作,在ABI 7500 Real Time PCR System进行RT-PCR。设定程序为： 95℃ 30s预变性; 95℃ 5s, 60℃ 34s,40个循环, 72℃延伸10min; 以β-actin(GenBank登录号：HQ441040.1)作为内参基因。反应体系为20 μL： SYBR®Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus,2×) 10 μL、PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL、RT反应液cDNA solution 2 μL、灭菌蒸馏水dH2O 6.8 μL。标准曲线： 处理组模板和对照组模板cDNA各取4个, 每个模板取3 μL混匀到一个PCR管内, 依次进行10×梯度稀释(即： 原始浓度、10×、100×、1000×、10000×), 形成5个浓度梯度。所有基因均按上述PCR步骤进行扩增, 得到标准曲线, 斜率K在-3— -3.5, PCR扩增效率为0.9—1.2效果最好。当目的基因和管家基因相同时可以使用2-ΔΔCt法[25]分析计算基因相对表达量。

1.5 数据处理

实验数据用SPSS Version16.0软件进行统计分析, 先对数据作单因素方差分析(One-way ANOVA),如有显著性差异(P＜0.05), 则做Duncan’s多重比较,实验数据用“平均数±标准差”()表示。

2 结果

2.1 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼生长性能的影响

由表 3可知, 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼的成活率无显著影响(P＞0.05); 增重率与特定生长率呈先上升后下降趋势, 但均显著高于对照组(P＜0.05), 在0.6%组达到最大值; 当添加0.4%和0.6%时,饲料系数最低, 蛋白质效率的变化规律则与饲料系数相反。以WGR为判断依据(图 1), 根据折线模型(y1=65.649x+709.06,R2=0.93;y2=-35.1x+751.86,R2=0.80)得出其促进斜带石斑鱼幼鱼生长最适添加量为0.42%。

2.2 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼体成分的影响

由表 4可知, 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼全鱼体内的水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分的含量均无显著影响(P＞0.05)。

表 3 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼生长性能的影响Tab. 3 Effects of L. acidophilus on growth performance of juvenile E. coioides (n=3)

图 1 嗜酸乳杆菌添加比例与斜带石斑鱼幼鱼增重率(WGR)关系模式图Fig. 1 Effects of supplemental level of L. acidophilus on WGR of juvenile E. coioides

2.3 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼消化酶活性的影响

由表 5可知, 肝脏和肠蛋白酶(TRY)、淀粉酶(AMY)活性呈先升高后降低趋势。其中, 肝脏淀粉酶、蛋白酶活性在添加量为0.6%达到最大值, 肠蛋白酶、淀粉酶活性分别在添加量0.2%和0.4%达到最大值。

2.4 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼相关酶mRNA表达的影响

嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼TRY、AMYmRNA表达的影响(图 2、图 3)。肝蛋白酶、淀粉酶mRNA表达量, 实验组均显著高于对照组(P＜0.05)。其中TRYmRNA相对表达量在添加量为0.8%达到最高值(图 2),AMYmRNA相对表达量在添加量0.4%达到最高值(图 3)。

2.5 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼抗病力的影响

由图 4可知, 哈维弧菌攻毒7d斜带石斑鱼幼鱼存活率随嗜酸乳杆菌添加比例的升高而增大, 各实验组存活率显著高于对照组(P＜0.05), 在添加比例1.2%达到最大值。

3 讨论

3.1 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼生长性能的影响

嗜酸乳杆菌是近几年常用的作为饲料添加剂的益生菌, 对水产动物具有促进生长的作用[26—29]。本实验结果表明, 在饲料中添加嗜酸乳杆菌可显著提高斜带石斑鱼幼鱼增重率、特定生长率, 降低饵料系数, 但其实际效果随着与嗜酸乳杆菌添加比例的变化而变化, 然而当添加过高的嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼促生长效果不明显。在添加比例0.6%时斜带石斑鱼幼鱼的增重率、特定生长率均显著高于对照组和1.2%组。以WGR为判断依据(图 1), 根据折线模型得出, 其促进斜带石斑鱼幼鱼生长最适添加量为0.42%, 表明嗜酸乳杆菌不同的添加比例会影响其作用效果。这与赵倩等[12]对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、吴志宏等[30]对大菱鲆(Psetta maxima)、郑伟宏[31]对奥杂罗非鱼(Oreochromis niloticus ×O. aureus)、Qin[32]对斑马鱼(Barchydanio rerio var)的研究结果类似。嗜酸乳杆菌促进斜带石斑鱼幼鱼生长的原因可能与其在鱼肠道内能较好地定植, 抑制肠道内有害菌生长, 不影响有益菌生长, 维持肠道菌群平衡[33,34]等作用有关。但添加比例过高其促生长作用不明显, 因此推测可能是由于过量的嗜酸乳杆菌会抑制其他益菌生长, 造成肠道有益菌群生态失衡, 从而影响斜带石斑鱼幼鱼生长。

3.2 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼消化酶活性的影响

生物体内消化酶活性可以反映机体消化能力的强弱, 研究消化酶活性可以进一步探究嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼的促生长作用机理[35,36]。鱼类中肝脏和肠道是分泌消化酶的重要器官[37], 本实验分别测定了斜带石斑鱼幼鱼肝脏和肠道中的消化酶(TRY、AMY)活性。结果表明： 肝脏和肠道蛋白酶(TRY)、淀粉酶(AMY)活性实验组均显著高于对照组。其中, 肝脏淀粉酶、蛋白酶活性在添加量为0.6%达到最大值, 肠蛋白酶、淀粉酶活性分别在添加量0.2%和0.4%达到最大值。这与异育银鲫(Allogynogenetic crucian carp)[38]、大菱鲆幼鱼[17]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[39]以及黄鳝(Monopterus al-bus)[40]的研究结果相似。嗜酸乳杆菌可以提高消化系统消化酶的分可能与其分泌的消化酶和消化器官的相互促进影响, 以及其本身分泌的乳酸等酸性物质可以降低消化腺pH刺激消化腺的代谢分泌活动进而提高消化酶的分泌量等作用有关[38,41]。嗜酸乳杆菌在机体内定植本身就可以抑制有害菌的生长, 此作用可能也会间接促进消化酶分泌, 提高消化酶活性[42]。

表 4 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼体成分的影响Tab. 4 Effects of L. acidophilus on body composition of juvenile E. coioides (%, n=3)

表 5 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼消化酶活性的影响Tab. 5 Effects of L. acidophilus on digestive enzyme activities of juvenile E. coioides (n=3)

图 2 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼肝脏TRY mRNA表达的影响Fig. 2 Effects of different L. acidophilus levels on TRY relative gene expression in liver of juvenile E. coioides

图 3 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼肝脏AMY mRNA表达的影响Fig. 3 Effects of different L. acidophilus levels on AMY relative gene expression in liver of juvenile E. coioides

图 4 哈维弧菌攻毒7d斜带石斑鱼存活率Fig. 4 Survival rate after 7d challenged with V. harveyi for juvenile E. coioides

3.3 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼消化酶mRNA表达的影响

蛋白酶、淀粉酶是机体内重要的消化酶, 研究这2种酶的mRNA表达有助于更深层次的解释嗜酸乳杆菌促进生长性能的作用机理。在本实验中石斑鱼肝脏的蛋白酶、淀粉酶mRNA表达量, 实验组均显著高于对照组(P＜0.05)。其中TRYmRNA相对表达量在添加量为0.8%达到最高值,AMYmRNA相对表达量在添加量0.4%达到最高值。结合添加嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼生长的影响结果, 其对消化酶活性以及相关酶mRNA表达均呈先升高后降低的趋势, 表明了幼鱼机体这些指标呈现一定的相关关系, 添加嗜酸乳杆菌可通过影响其消化酶的活性及相关酶的基因表达量, 从而进一步影响其生长。目前, 有关嗜酸乳杆菌对陆生动物及水产动物消化酶活性的研究有很多, 但未见对消化酶mRNA表达的影响相关报道。本结果可以为以后的相关研究提供参考。

3.4 嗜酸乳杆菌对斜带石斑鱼幼鱼抗病力的影响

在水产养殖过程中, 鱼病是困扰很多养殖户的问题, 大多数是因为致病有害菌在体内生长繁殖所导致, 预防措施不好, 导致死亡率极高, 鱼存活率的多少就是鱼体抗病力的外在直观体现, 哈维弧菌是水产养殖过程中致病率比较高的有害菌之一[35]。因此, 在生长实验结束后, 以哈维弧菌进行攻毒实验, 观察记录7d的存活率得出, 斜带石斑鱼幼鱼的存活率与嗜酸乳杆菌的添加比例的呈正相关关系,说明添加嗜酸乳杆菌能够有效地提高斜带石斑鱼幼鱼的抗病力。这与黄燕华等[43]对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)、温俊[44]对牙鲆(Paralichthys olivaceus)的攻毒实验结果相似。本实验结果表明斜带石斑鱼幼鱼的抗病力是随着嗜酸乳杆菌添加比例升高而提高。这可能与嗜酸乳杆菌可以抑制有害菌生长有关, 且添加比例越高,抑菌用越明显。在本实验中, 添加嗜酸乳杆菌可以提高斜带石斑鱼的生长性能和消化酶活性以及抗病力, 以WGR为判断依据(图 1), 根据折线模型(y1=65.649x+709.06,R2=0.93;y2= -35.1x+751.86,R2=0.80)得出其最适添加量为0.42%。综合消化酶活性, 消化酶相关mRNA表达量, 以及攻毒后成活率的影响结果, 可见当添加嗜酸乳杆菌促进肠道健康, 消化能力提高, 所含有益菌群比较多, 进而提高鱼的抗病力。

4 结论

综上所述, 在饲料中添加嗜酸乳杆菌可促进斜带石斑鱼幼鱼生长, 提高消化酶活性、抗病力和AMY、TRYmRNA相对表达水平。以WGR为判断依据, 根据折线模型得出嗜酸乳杆菌最适添加量为0.42% (0.72×108cfu/g)。