氨基酸代谢调控在大鳞副泥鳅应对氨暴露中的作用

张云龙 王光毅 金 慧 董昭然 张子涵 谢云轶

(安徽农业大学动物科技学院, 合肥 230036)

氨是养殖水体中常见的污染物, 对水生动物的危害很大[1], 可引起摄食及生长降低[2,3]、鳃结构异化[4]、细胞凋亡以及氧化应激[5]等副作用。由于氨的强毒性, 养殖水体中的氨氮浓度应保持在相对较低的水平下[6,7]。然而, 一些气呼吸型鱼类, 如大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)[8]、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[9,10]及黄鳝(Monopterus albus)[11]等, 可耐受相当高浓度的体外或体内氨。其原因在于这些鱼类具有一种或多种有效的氨耐受策略, 如合成谷氨酰胺、合成尿素排出、增强机体排泄、Rh蛋白促进氨解毒、降低周围环境pH、NH3挥发和体表碱化、降低体内氨生成、特定氨基酸代谢生成丙氨酸以及组织高氨耐受性等[1]。

通常来讲, 降低体内蛋白水解及氨基酸代谢是有效的氨解毒策略, 因为此过程抑制了体内氨的生成。但此过程同样抑制了鱼体通过氨基酸代谢供能, 而且鱼类在应激状态下需要消耗更多的能量[12]。因此, 某些鱼类对这一策略进行了调整, 通过转氨基(如谷氨酸、精氨酸和脯氨酸)作用将一些特定氨基酸转化为丙氨酸并生成ATP。例如, 1 mol谷氨酸转化为丙氨酸可生成10 mol ATP[10], 而实际上这一系列的转氨基作用并未产生体内氨[1]。从这个角度看, 通过代谢某些特定氨基酸转化为丙氨酸可能是一种非常有效的氨解毒策略, 而且在对泥鳅[9,10]、月鳢(Channa asiatica)[13]及鲤(Cyprinus carpio)[14]的研究中也证实了这一策略的有效性。

大鳞副泥鳅是我国重要的经济水产动物品种,近年来市场需求量居高不下[15,16]。大鳞副泥鳅是一种典型的气呼吸型鱼类, 以后肠作为辅助呼吸器官[17]。前期研究结果表明大鳞副泥鳅在氨暴露下,体组织会累积相当高浓度的氨[8,18], 其应对如此高浓度的体外和体内氨的机理如何？ 本研究测定了不同时间氨暴露对大鳞副泥鳅体组织中游离氨基酸(FAA, free amino acids)含量的影响, 旨在阐明氨基酸代谢调控在大鳞副泥鳅应对高浓度环境氨中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

试验用大鳞副泥鳅(20—29 g)由合肥市某农贸市场购得, 转运至实验室中养殖于5个60 L的循环水族缸中(盛水50 L), 每个缸中养殖30—50尾并放置3个充气石。试验鱼在实验室中暂养7d后开始试验, 暂养期间水温(25.5±1.0)℃, 每天投喂2次商品配合饲料(粗蛋白35%, 粗脂肪7%), 每天下午换水30%。试验开始前24h停止投喂, 整个试验期间也不投喂。

1.2 氨暴露设计

随机选取4尾规格较为接近的试验鱼, 放置于圆形塑料盆中(直径35.5 cm, 高度15.5 cm), 盆中装有10 L 30 mmol/L的NH4Cl溶液。暴露时间设置为0、12h、24h、48h、72h、96h, 每隔24h将盆中的NH4Cl溶液彻底更换一次以保证氨浓度稳定, 试验期间室温(24±1)℃。以4尾试验鱼暴露于10 L曝气纯水中0、12h、24h、48h、72h、96h作为对照组。氨暴露组和对照组每个暴露时间点均设置3个平行, 共36个容器, 每个容器中4尾试验鱼。

1.3 取样

在每个暴露时间点结束后, 将每个盆中的4尾试验鱼以MS-222麻醉后, 以1 mL注射器从尾静脉取血, 置于肝素钠润洗过的抗凝管中。在取血结束后, 将血液样品在转速3500 r/min, 温度4℃的条件下离心30min, 取上清液制备血浆。随后, 所有试验鱼通过敲击头部致死, 解剖后取肝脏组织和背部肌肉。所有样品均由4尾试验鱼合并而来, 并保存于-80℃中待测。

1.4 游离氨基酸测定

取0.5 mL解冻的血浆样品, 加入2.5 mL 4%的磺基水杨酸溶液, 充分混合后置于转速14000 r/min、温度4℃条件下离心30min, 取上层清液用于游离氨基酸测定。对于肝脏和肌肉样品, 首先将解冻后的样品置于105℃烘箱中烘干至恒重。取0.5 g干样品以研钵研磨成粉状, 加入5 mL 4%的磺基水杨酸溶液, 充分混合后置于转速14000 r/min、温度4℃条件下离心30min, 取上层清液用于游离氨基酸测定。以真空抽滤泵对前处理所得的上清液进行过滤(滤膜孔径0.22 μm), 随后使用Hitachi L-8900全自动氨基酸分析仪检测各样品中的游离氨基酸含量。

1.5 数据统计

所有数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示,以Levene’s检验进行方差同质性分析。单因素方差分析(ANOVA)检验不同暴露时间点之间的差异显著性, 如果差异显著则进行Duncan’s多重比较。t检验分析各暴露时间点氨暴露组与对照组之间的差异显著性。显著性水平α=0.05, 所有数据分析以SPSS 18.0统计软件完成。

2 结果

不同时间氨暴露对大鳞副泥鳅血浆中游离氨基酸含量的影响见表 1。结果表明大多数血浆中的游离氨基酸含量受氨暴露的影响(P＜0.05)。在同一暴露时间下, 多数氨暴露组中血浆中谷氨酸、色氨酸及精氨酸等游离氨基酸含量均显著低于对照组(P＜0.05)。而随着氨暴露时间的延长, 大鳞副泥鳅血浆中丙氨酸的含量显著增加, 且每一暴露时间点均显著高于对照组(P＜0.05, 图 1A)。

表 2列出了不同时间氨暴露后大鳞副泥鳅肝脏中游离氨基酸含量的变化。从表中可看出, 几乎所有可检测的肝脏游离氨基酸含量均受不同时间氨暴露的影响(P＜0.05)。30 mmol/L NH4Cl溶液暴露大鳞副泥鳅12h后, 其肝脏组织中游离谷氨酸含量开始显著上升(P＜0.05), 而在暴露72h后迅速下降(P＜0.05); 对照组中谷氨酸含量变化趋势也为先上升后下降。大鳞副泥鳅肝脏中游离丙氨酸含量在氨暴露的前24h内基本保持恒定, 随后开始显著上升(P＜0.05)并持续至72h, 之后显著下降(P＜0.05)并在暴露96h时达到最低值(图 1B)。在对照组中, 游离丙氨酸含量在24h时达到最大值并显著高于氨暴露组(P＜0.05), 随后开始显著降低(P＜0.05), 在48—96h三个时间点均显著低于氨暴露组(P＜0.05,图 1B)。肝脏组织中游离精氨酸和脯氨酸含量均在氨暴露后有明显降低(P＜0.05), 且在暴露24h后显著低于对照组(P＜0.05)。

相似地, 大鳞副泥鳅肌肉游离氨基酸含量均受不同时间氨暴露的影响(表 3,P＜0.05)。在对照组中, 肌肉游离谷氨酸含量随着时间延长有明显的增加趋势(P＜0.05)。30 mmol/L NH4Cl溶液暴露大鳞副泥鳅12h后, 肌肉中游离谷氨酸含量显著上升(P＜0.05), 随后快速下降至初始水平并保持到实验结束(P＞0.05), 且在暴露72h和96h时显著低于对照组(P＜0.05)。肌肉中游离丙氨酸含量随着氨暴露时间的延长呈先上升后降低的趋势, 并在暴露12h和48h时出现2个峰值, 且显著高于对照组(P＜0.05, 图 1C)。肌肉中游离精氨酸和脯氨酸含量也随着氨暴露时间的延长呈现上升后降低的趋势, 并均在氨暴露72h后显著低于对照组(P＜0.05)。

表 1 不同时间氨暴露对大鳞副泥鳅血浆中游离氨基酸含量的影响Tab. 1 Effects of ammonia exposure on plasma FAA contents (μg/mL, n=3) of P. dabryanus

3 讨论

抑制体内蛋白水解和氨基酸代谢可能是鱼类应对氨氮毒性的有效策略之一, 其可降低鱼类机体内氨含量。然而, 这种情况也同样抑制了利用氨基酸作为能量源, 这对某些特定鱼类来说并不合适,如许氏齿弹涂鱼(Periophthalmodon schlosseri)需要在滩涂地上运动[19]。因此, 某些气呼吸型鱼类在抑制体内蛋白水解和氨基酸代谢的同时会代谢某些特定氨基酸以保证能量供应。如谷氨酸可通过一系列转氨基作用转化为丙氨酸, 且不涉及氨的释放(图 2)[1]。从这一点来说, 特定氨基酸代谢生成丙氨酸也是鱼类应对氨氮毒性的有效策略之一, 而且这一过程还可提供机体必要的ATP。

谷氨酰胺已被证实在鱼类氨解毒中具有重要的作用, 如泥鳅[9]、云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marnorata)[20]、中华乌塘鳢(Bostrichyths sinensis)[21]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[22]、黄鳝(Monopterus albus)[23]及仿刺参(Apostichopus japonicus)[24]等。在鱼体内, 谷氨酰胺合成酶可催化谷氨酸和合成谷氨酰胺。在本研究中, 大鳞副泥鳅暴露于30 mmol/L NH4Cl溶液中, 血浆、肝脏及肌肉中游离谷氨酸含量相较于对照组均有明显的降低。此外, 大鳞副泥鳅暴露于30 mmol/L NH4Cl溶液中, 随着暴露时间的延长, 大鳞副泥鳅体组织中的谷氨酰胺含量及谷氨酰胺合成酶活性均有明显的上升[18]。由此可见, 在高环境氨条件下, 大鳞副泥鳅会利用谷氨酰胺合成酶将谷氨酸和合成无毒的谷氨酰胺以降低氨毒性。以谷氨酰胺的形式应对较高的体内氨氮含量具有其特定的优势, 谷氨酰胺可贮存于机体中, 当环境条件改善后, 这些谷氨酰胺可用于合成嘌呤、嘧啶及黏多糖等机体生理活动[7]。前期对于虹鳟[22]、尖齿胡鲶(Clarias gariepinus)[25]及黄鳝[26]等鱼类的研究也发现了类似的结果。

有许多氨基酸可被转氨基作用代谢为丙氨酸且不产生氨, 如1 mol谷氨酸转化为丙氨酸可产生10 mol ATP, 而精氨酸和脯氨酸转化为丙氨酸生成的ATP量则更大[1]。从本质上来说, 转氨基作用与脱氨基作用不同, 并不涉及体内氨的生成, 这对鱼类来说是较为理想的耐氨策略(图 2)。在本研究中,大鳞副泥鳅在氨暴露下, 其血浆中游离丙氨酸含量持续上升, 而肝脏和肌肉中游离丙氨酸含量则是先上升后下降。类似的结果还见于泥鳅[9]、月鳢[13]及许氏齿弹涂鱼[27]等, 说明这些气呼吸型鱼类可通过代谢某些特定氨基酸生成丙氨酸以降低体内氨的累积。而大鳞副泥鳅体组织中游离谷氨酸、精氨酸和脯氨酸含量的降低也说明其可通过转氨基作用将这些特定氨基酸转化为丙氨酸, 以降低体内氨的生成并提供能量。此外, 大鳞副泥鳅暴露于30 mmol/L NH4Cl溶液中12h后, 其血浆中血糖及乳酸含量显著高于对照组(未发表数据), 结合本研究的结果可以说明特定氨基酸代谢这一耐氨策略的启用与暴露时间及机体能耗相关, 即暴露时间越长、机体能耗越高则越有可能进行特定氨基酸的转氨基作用。

图 1 不同时间氨暴露对大鳞副泥鳅血浆(A)、肝脏(B)和肌肉(C)中游离丙氨酸含量的影响Fig. 1 Effects of ammonia exposure on the FAA contents of the plasma (A), liver (B) and muscle (C) of P. dabryanus

表 3 不同时间氨暴露对大鳞副泥鳅肌肉组织中游离氨基酸含量的影响Tab. 3 Effects of ammonia exposure on muscle FAA contents (mg/g dry weight, n=3) of P. dabryanus

综上所述, 30 mmol/L NH4Cl溶液暴露大鳞副泥鳅会显著影响其血浆、肝脏及肌肉组织中游离氨基酸含量。在氨暴露下, 其血浆、肝脏及肌肉中游离谷氨酸含量显著降低, 且谷氨酰胺含量和谷氨酰胺合成酶活性显著提高, 说明在高环境氨条件下,大鳞副泥鳅会利用谷氨酰胺合成酶将谷氨酸和合成无毒的谷氨酰胺以降低氨毒性。随着氨暴露时间的延长, 大鳞副泥鳅血浆和组织有明显的丙氨酸累积且游离谷氨酸、精氨酸和脯氨酸含量显著降低, 说明其可通过代谢这些特定氨基酸生成丙氨酸以降低体内氨的累积。

图 2 鱼类特定氨基酸代谢示意图Fig. 2 Partial amino acid catabolism leading alanine formation in fish species