松潘裸鲤仔稚鱼耳石生长轮日周期确证及其孵化期推算

严太明 张松培 何 亮 罗 杰 何 智

(四川农业大学动物科技学院, 成都 611130)

鱼类耳石微结构特征具有种属特异性[1,2], 通过建立耳石微结构特征与早期生活史事件的对应关系, 可以利用耳石微结构分析反映鱼类个体的早期生长发育状况及其与生活环境的关系[3,4]。基于耳石微结构特征而建立的耳石日轮技术已广泛应用于鱼类早期生活史研究、产卵场位置和产卵期的推算等[5—8]。

松潘裸鲤(Gymnocypris potanini)隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)裸鲤属(Gymnocypris)[9], 是分布于岷江上游和澜沧江水系的一种小型裂腹鱼类, 主要生活在常年低温的山区河流, 研究也证实在其人工养殖条件下胚胎发育的孵化温度和幼鱼饲养水温不宜超过23℃[11—13]。受水电水利工程的兴建和捕捞强度增大的影响, 松潘裸鲤生境大幅压缩, 资源量锐减, 物种生存受到严重威胁[10]。目前, 有关其耳石微结构特征等的报道仅见Song等[11]对采自岷江支流杂谷脑河古尔沟段的松潘裸鲤幼鱼样本的分析结果： 在采集的120尾样本中, 绝大多数微耳石和矢耳石具有多个原基, 且矢耳石的论文清晰度高于微耳石, 基于耳石轮纹数推测这些样本的日龄在14—22d, 孵化期日期为6月中下旬。本文采用COⅠ序列辅助鉴定物种, 对2015年和2016年野外采集的松潘裸鲤仔稚鱼的耳石形态变化、轮纹沉积规律等耳石微结构特征进行了分析, 并利用耳石日轮技术推算了其在野外的孵化期, 旨在为松潘裸鲤的资源保护提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验样本来自2015年8月5日在四川理县杂谷脑河(岷江上游一级支流)支流孟屯河上游河段(N：31°43′57.82″, E： 103°2′11.37″)用20目围网捕获的鱼类仔稚鱼。在样本带回实验室后, 部分置于白色塑料盆(36.0 cm×28.0 cm×12.0 cm)内饲养用于轮纹沉积规律确证, 部分样本直接用无水乙醇固定。固定样本在显微镜下挑取微耳石和矢耳石, 无水乙醇清洗后用中性树胶固定于载玻片上用于耳石微结构特征分析。在显微镜下统计微耳石和矢耳石轮纹数, 用Olympus CKX41照相系统对耳石样本形态进行观察并拍照, 以及测量微耳石和矢耳石轮纹宽度(测量起点为耳石原基边缘位置)。

为进一步确定其仔鱼孵出时间, 2016年9月10日再次在2015年样品采集地用同样的方式采集仔稚鱼。捕获的松潘裸鲤仔稚鱼直接用无水乙醇固定, 在室内进行耳石样本的挑取和分析。

1.2 仔稚鱼物种确证

根据《四川鱼类志》和《中国动物志硬骨鱼纲鲤形目(下卷)》等资料, 结合实地走访, 初步判断采集的仔稚鱼隶属于裂腹鱼亚科鱼类。为进一步准确判断其种属, 采用线粒体细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)引物(COⅠF： TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC;COⅠR： TAGACTTCTGGTGGCCAAAGAATCA)进行PCR扩增获取其COⅠ序列, 并利用Clustal X 1.81和MEGA 8.0软件对序列进行同源比对, 构建系统进化树辅助鉴定物种。

1.3 耳石轮纹特征研究

采用温度标记法[12](12—18℃)对仔稚鱼耳石轮纹进行标记, 以24h (12h高温—12h低温)为一个周期, 间隔1天取样1次。具体操作为： 9：00—21：00置放于温度为(18.0±0.5)℃的生化培养箱中培育,21：00—9：00置放于温度为(12.0±1.0)℃的生化培养箱培育。在进行温度标记实验前, 将实验鱼恒温(20.0±1.0)℃培养24h, 以确定标记起点。实验期间分别于8：00和18：00换水之前30min投喂消毒捣碎后的水蚯蚓, 并换等温曝气的自来水。

实验鱼用盐酸利多卡因(浓度为30 mg/L)麻醉并断头后, 在显微镜下挑取微耳石和矢耳石, 无水乙醇清洗后用中性树胶固定于载玻片上, 并统计微耳石和矢耳石轮纹数。

1.4 繁殖期推算

参照裂腹鱼等鱼类的日龄可用日轮数N+1表示的方法[13,14], 结合本研究确定的耳石轮纹沉积的周期性规律, 通过采样日期和微耳石日轮数推算仔稚鱼孵化期。

1.5 数据和图片处理

2 结果

2.1 仔稚鱼物种确定

随机选取的10个样本经过PCR扩增和测序获得片段大小为700 bp的10条序列(GenBank ID：MK716222—MK716231)。裸鲤属鱼类的COⅠ系统发育进化树结果表明, 所获得序列与裸鲤属几个物种聚在一起形成单系(图 1), 且与GenBank中松潘裸鲤共享同一个单倍型。因此, 可以确定所采集仔稚鱼为松潘裸鲤(Gymnocypris potanini)。

2.2 轮纹沉积周期规律确证

轮纹数统计结果表明, 仔稚鱼恒温培养24h出现较宽的1轮标记轮, 之后每标记2天形成2个标记轮。温度标记处理后的耳石轮纹界限较未温度标记处理更清晰, 轮纹宽度均匀(图 2A和2B)。微耳石标记轮纹数量(Increment number of lapilli,I)与轮纹标记时间(Days,D)呈线性相关, 回归方程为：I=1.0065D-0.0643 (R2=0.9921,n=41, 图 2C), 方程斜率与1差异不显著(P＞0.05), 这表明松潘裸鲤轮纹沉积具有日周期性, 生长轮为日轮。

2.3 日龄构成与孵化期推算

统计结果表明, 2015年松潘裸鲤样本微耳石(n=45)轮纹数范围为34—46轮, 其中比例最高的为41轮和43轮, 均占总数的13.33%, 其次为42轮, 占总数的11.11% (图 3A)。矢耳石(n=41)轮纹数范围为34—46轮, 其中比例最高的37轮, 占总数的14.63%,其次为34轮和41轮, 均占总数的12.20% (图 3B)。

松潘裸鲤孵化期依据日龄为日轮数N+1的关系式进行推算。统计结果表明, 2015年的45个样本的出膜时间为6月29日至7月15日, 历时14d。出膜高峰期在7月2日至7月12日, 其中7月9日出膜仔鱼数量最多, 占样本量的14.63% (图 4A)。

2016年的328个样本孵化期为7月13日至8月18日, 历时37d。出膜高峰期7月27日至8月13日, 其中8月3日出膜个体数量最多, 占样本量的6.71%; 其次为8月2日和8月6日, 占样本量的6.40% (图 4B)。

2.4 耳石形态变化和轮纹宽度

微耳石形态变化随着轮纹数的增加相对稳定。轮纹数为34的微耳石近圆形, 背区平直, 腹区呈圆弧状(图 5A); 轮纹数为40的微耳石呈贻贝形,背区微凹(图 5B), 而背区凹入明显则出现在轮纹数为46轮的微耳石中(图 5C)。

与微耳石相比, 矢耳石形态变化明显。轮纹数为34轮的矢耳石呈楔形, 后端基叶呈尖状突起(图 5D);40轮矢耳石基叶突出明显, 前端有向背侧方向弯曲的趋势, 后端向腹侧方向弯曲并向后延伸, 略钝圆(图 5E); 46轮的矢耳石呈明显的箭矢状： 前端钝圆,后端细长光滑并有明显的嵴, 并与腹区形成小凹,背区较平直(图 5F)。

图 2 松潘裸鲤仔稚鱼微耳石标记轮纹数量(A和B)及轮纹数和标记时间的关系(C)Fig. 2 The characteristics of the marked increment and the relationship between time and the number of increment of lapilli in Gymnocypris potanini larvae

图 3 2015年样本微耳石(A)和矢耳石(B)轮纹数Fig. 3 Increment number of Lapillus and Sagitta

图 4 2015年(A)和2016年(B)松潘裸鲤仔稚鱼孵化期Fig. 4 Hatching-date distributions of Gymnocypris potanini larvae in 2015 (A) and 2016 (B)

图 5 松潘裸鲤仔稚鱼微耳石和矢耳石形态发育Fig. 5 Otolith development in Gymnocypris potanini larvae

图 6 松潘裸鲤微耳石(A)和矢耳石(B)轮纹宽度变化Fig. 6 Trajectory of the increments width of lapilli (A) and sagittae (B) in Gymnocypris potanini larvae and juvenile

轮纹宽度分析结果表明, 仔稚鱼微耳石(n=44)和矢耳石(n=33)的轮纹宽度随着日龄的增加均有增大的趋势(图 6)。微耳石变化为(1.29±0.77)—(2.68±1.03) μm; 矢耳石变化为(1.42±0.50)—(4.82±1.80) μm。其中, 微耳石轮纹宽度最小为第6轮, 最大第30轮,而矢耳石最小为第11轮, 最大第39轮。

3 讨论

基于耳石微结构特征而建立的耳石日轮技术在应用于鱼类早期生活史、孵化期或产卵期、个体发育情况和鱼苗种群等的研究之前, 需对其耳石微结构特征进行评估。鱼类耳石上第一条轮纹形成时间是利用耳石研究鱼类日龄等早期生活史的前提, 通过结合耳石初始日轮的出现时间及轮纹沉积规律, 并结合耳石轮纹数建立的耳石日轮技术可对鱼类的日龄或孵化期进行推算[15,16]。相关研究证实, 耳石第一轮纹的形成具有物种特异性, 且和环境条件、个体发育等息息相关[17,18]。在本研究中, 采集到的仔鱼已出膜, 不能判断第一轮纹出现的具体时间, 故参照裂腹鱼亚科的齐口裂腹鱼(Schizothorax prenonti)和骨唇黄河鱼(Chuanchia labiosa)等的研究结果[13,14], 推测其第一轮纹出现时间为出膜后第二天。此外, 虽然大多鱼类耳石轮纹沉积具有日周期性, 但沉积规律作为耳石日轮技术应用的关键参数, 对孵化期推算的正确性起着决定性作用, 故最好能在应用前对其沉积规律进行有效评估[19,20]。因此, 本文采用温度标记法确证了松潘裸鲤仔稚鱼的耳石轮纹沉积具有日周期性。这与裂腹鱼亚科的齐口裂腹鱼和骨唇黄河鱼等的研究结果类似[13,14]。综上, 松潘裸鲤的日龄(D)仍可用日轮数(N)+1表示。

鱼类3对耳石上均有轮纹存在, 但出现时间和清晰度等存在较大差异[21]。由于星耳石轮纹出现晚且不清晰等的限制[22], 耳石日轮技术中日龄的鉴定往往采用微耳石和矢耳石。研究发现, 三峡水库太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis)和珠江口黄唇鱼(Bahaba flavolabiata)等矢耳石的轮纹微结构能较好的满足其仔稚鱼产卵期、生长等方面的分析要求[22—24], 但大多数淡水鱼类, 尤其是鲤科鱼类矢耳石易碎, 形态不规则且轮纹不易辨别, 如小眼须雅罗鱼(Semotilus corporalis)和草鱼(Ctenopharyngoolon idellus)等[7,23]。此外, 相较于矢耳石形态变化,在仔稚鱼发育过程中微耳石形态总体变化不大, 较适合作为鱼类日轮分析的研究材料[13,14,25,26]。Song等[11]的研究结果中发现, 松潘裸鲤耳石轮纹在13.0—21.5轮时, 矢耳石大多呈圆形、卵圆形或长椭圆形, 微耳石呈圆形或卵圆形, 此时, 矢耳石的轮纹清晰度高于微耳石, 为此采用矢耳石进行轮纹统计较为适宜。而在本研究中, 矢耳石和微耳石轮纹在33—46轮, 矢耳石形态处于由楔形到箭矢状的剧烈变化过程中, 这就使得矢耳石挑取过程中易碎且轮纹相对模糊不易识别, 而微耳石在生长过程中变化甚微, 生长轮的清晰度较高, 轮纹易于区别, 故此时微耳石较适宜作为日轮鉴定材料。综上, 在进行松潘裸鲤日轮统计时, 早期稚鱼建议以矢耳石为材料, 后期稚鱼最好采用微耳石为鉴定材料。

本文从杂谷脑河支流孟屯河采集的松潘裸鲤仔稚鱼微耳石[(1.29±0.77)—(2.68±1.0)3 μm]和矢耳石[(1.42±0.50)—(4.82±1.80) μm]轮纹宽度较Song等[11]从杂谷脑河干流采集样本的耳石轮纹宽度窄[微耳石(4.25±0.427) μm和矢耳石(5.44±0.409) μm]。孟屯河水流湍急, 沟谷狭窄属于杂谷脑河的一级支流, 采集地距离汇合口的距离为45.0 km左右, 采集地的水温低于干流的水温2.2—2.5℃。由此可推测, 松潘裸鲤仔稚鱼耳石轮纹宽度的差异可能与鱼类采集地的水温不同有较大关系。类似的结果在白鲑属鱼类也得以证实： 高温标记的耳石轮纹宽度明显宽于低温标记的耳石轮纹宽度[27]。此外, Song等[11]样本采集时间在夏季, 而本研究样本采集时间在秋季, 饵料丰度也可能影响其轮纹宽度的原因之一。

此外, 松潘裸鲤耳石轮纹宽度整体呈先逐渐变窄、后增宽的趋势。其中, 微耳石轮纹宽度在前6轮下降的趋势较矢耳石明显, 后期进入实验室养殖条件后, 耳石轮纹宽度增宽的趋势均较明显, 这种轮纹宽度的变化趋势与长江口凤鲚(Coilia mystus)[28]、香鱼(Plecoglossus altivelis)[29]和太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis)等的研究结果类似。松潘裸鲤胚后仔鱼的研究结果表明, 出膜后第6天仔鱼开始平游和觅食[30], 仔鱼的食性转变恰好与耳石轮纹宽度变窄相吻合。

本研究基于耳石日轮技术[31,32]推算出, 孟屯河上游2015年采集的仔稚鱼样本的孵化时间为6月29日至7月15日, 2016年样本的孵化时间为7月13日至8月18日, 晚于干流杂谷脑河捕获的仔稚鱼的孵化期6月17—25日[11]。吴青等[30]研究结果发现, 松潘裸鲤胚胎在(17±2)℃和11—17℃流水环境中历时204h和248h出膜。综上可知, 杂谷脑河流域松潘裸鲤的产卵时间可能开始于6月初, 产卵活动会一直持续2个月左右。因此, 6—8月是杂谷脑河干支流松潘裸鲤产卵繁殖的重要时段, 故在此期间应做好产卵群体鱼类的保护工作, 以保证其野生资源得以较好的补充。