浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究

2019-10-20 03:21王远锏黄浩胜陈震宇
科学导报·科学工程与电力 2019年12期
关键词:宿主癌细胞活性

王远锏 黄浩胜 陈震宇

【摘 要】来自于细菌和真菌等微生物的L-天冬酰胺酶通过切断癌细胞L-天冬酰胺的来源实现治疗癌症,本身存在如低毒性、致敏性等问题。使用的重组表达载体将具有无谷氨酰胺酶活性L-天冬酰胺酶提取并生产,扩大L-天冬酰胺酶表达能力并提高其工业化生产潜力。

【关键词】L-天冬酰胺酶;重组表达载体;

1 结构、性质、作用机理

癌细胞无法合成天冬酰胺而从周围细胞中获取。L-天冬氨酸酶降解L-天冬酰胺,切断癌细胞L-天冬酰胺来源抑制癌细胞生长。大肠杆菌中细胞质中表达L-天冬酰胺酶I组成型,具有低速水解L-天冬酰胺(L-Asn)与L-谷氨酰胺(L-Gln)的能力;在缺氧条件下,大肠杆菌周质空腔中积累形成包涵体,具有抗蛋白酶、对宿主毒性小、容易富集纯化等优点。L-天冬酰胺酶II为4亚基同聚体,该酶的四聚体形态具有活性,活性中心包括Lys、Cys、His三个氨基酸。细菌来源的L-天冬酰胺酶具有少量的谷氨酰胺酶活性,易产生过敏与超敏反应、血栓及出血等副作用,对肝脏毒害较大。

2 来源与生产

L-天冬酰胺酶在多种微生物体内均有表达,大肠杆菌是天冬酰胺酶药物最初来源,其L-天冬酰胺酶表达系统研究较为清楚。根据L-天冬酰胺酶II基因表达与ansB启动子有关[1],受cAMP受体蛋白正调控与厌氧负调控。当胞内为低水平葡萄糖含量,cAMP含量升高,cAMP-cAMP受体蛋白复合物含量增加并结合ansB启动子中CAP结合位点,σ70RNA聚合酶与启动子结合强度提高,基因表达水平上升。除了大肠杆菌之外,真菌也是研究生产L-天冬酰胺酶的对象,Vijay[2]使用土曲霉MTCC1782作为培养对象生产L-天冬酰胺酶,产物产量与安全性都有提高。

3 L-天冬酰胺酶重组表达体系

在L-天冬酰胺酶的生产体系中主要包括大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、巴斯德毕赤酵母菌表达系统。低成本,高产量,生产周期短的大肠杆菌表达系统目前较为常用,梁毅偈等[3]完成了大肠杆菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达,但产物无法正确折叠。枯草芽孢杆菌表达系统蛋白质分泌能力强,分泌蛋白纯化难度低。Feng Y等[4]将基因与含p43强启动子的表达载体pP43NMK重组并导入Bacillus subtilis WB600,在宿主菌中成功实现L-天冬酰胺酶II的重组表达。另外修改组合策略可提高L-天冬酰胺酶在宿主体内的表达水平。巴斯德毕赤酵母表达系统可以对自身表达的蛋白质进行加工,生产的L-天冬酰胺酶更加安全,目前Nagarajan A[5]等人从内生真菌中成功筛选并分离到新型无谷氨酰胺酶L-天冬酰胺酶。酵母表达系统产可以适应高密度发酵,重组体系产品易于纯化,是目前一种具有较高应用潜力的的L-天冬酰胺酶表达体系。

参考文献:

[1] ?ebnem E,Hikmet G.Cloning,isolation and expression of l -asparaginase gene(ansB)in different gram-negative bacteria expressing Vitreoscilla hemoglobin[J].Curr Opin Biotech,2011,22.

[2] Vijay B,Raju K J.Production of L-asparaginase by Aspergillus terreus MTCC 1782 under solid state fermentation using pearl millet and finger millet as mixed substrate[J]J Chem,Biol Phys Sci.2015,5(1):366-377.

[3] 梁毅偈,孙运军,胡胜标,等.大肠杆菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达与抗肿瘤活性[J].微生物学通报,2014,41(4):607-613.

[4] Feng Y,Liu S,Jiao Y,et al. Enhanced extracellular production of L-asparaginase from Bacillus subtilis 168 by B.Subtilis WB600 through a combined strategy[J]Appl Microbiol Biot.2017,101(4):1509-1520.

[5]Nagarajan A,Thirunavukkarasu N,Suryanarayanan T S,et al.Screening and isolation of novel glutaminase free L-asparaginase from fungal endophytes[J] Res J Microbiol.2014,9(4):163-176.

(作者單位:华南师范大学(石牌校区)生命科学学院)

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