不同耐热三色堇材料HSP70基因克隆及热胁迫下的表达分析

牛杨莉，朱小佩，杨亚萍，葛晓敏，杜晓华，刘会超

(河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡 453003)

三色堇(Violatricolor)，又名蝴蝶花、猫脸花，为堇菜科堇菜属多年生草本观赏花卉，作为重要的花坛花卉，在我国很多城市栽培应用，市场需求量很大。然而三色堇不耐高温，当气温超过30 ℃便不能进行花芽分化，且植株生长不良[1]。因此，高温是影响三色堇推广应用的一个限制因素。

热激蛋白(Heat shock protein，HSP)是细胞受到高温或其他胁迫条件诱导而表达提高的一类功能型蛋白，广泛分布于原核生物和真核生物中，作为分子伴侣协助蛋白质正确折叠，促使其他蛋白质的重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解，增强细胞抵抗胁迫环境的忍耐力，从而提高适应性[2]。其中,HSP70是热激蛋白家族中重要成员，在植物受到热胁迫时，能够被快速诱导并大量表达[3]。拟南芥在热胁迫中过表达HSP70-1基因，证明HSP70能有效提高转基因植株的耐热性[4]。HSP70基因家族成员庞大，目前，发现拟南芥有18个HSP70基因[5]，水稻32个[6]，芝麻21个[7]，大豆61个[8]，棉花30个[9]，辣椒21个[10]。HSP70基因家族结构高度保守，且分布于细胞核、细胞质、内质网、线粒体和叶绿体等细胞的各个部分。

河南科技学院三色堇资源与育种课题组自2006年开始进行三色堇资源的收集评价工作，通过自交选育、生理指标分析及田间耐热性鉴定，从100多份三色堇材料中筛选出了3份耐高温三色堇材料HAR、DFM-16和DFM-17。在热胁迫下，这些耐热材料的热害指数和细胞膜受损程度都明显低于不耐热材料[11]。前期从耐高温材料HAR中分离到了1个HSP70基因[12]。但其他耐热材料的HSP70基因是否与其相同，热敏材料的HSP70是否存在差异，是值得探索的问题。为此，以耐热材料DFM-16和热敏材料08H为试材，测定其HSP70基因序列，并分析热胁迫条件下基因的表达模式，为进一步解析三色堇的耐高温分子机制提供基础，同时也为挖掘和鉴定重要的高温应答基因、培育耐高温三色堇新种质提供重要的基因资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试材为本课题组选育的耐热三色堇资源DFM-16和热敏三色堇资源08H,其来源与表型见表1。试验所用幼苗经种子播种繁殖，在育苗室培育。培育条件：昼/夜温度20 ℃/15 ℃，光照16 h/d，2个月后植株真叶数达到6～7片时进行处理、取材。

表1 三色堇资源名称及表型Tab.1 The names and phenotypes of pansy resource

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒和DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。cDNA反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、凝胶回收试剂盒、荧光定量试剂、TaqDNA聚合酶、pMD18-T载体以及DNA Marker购自TaKaRa生物公司。

1.3 cDNA合成及基因组DNA(gDNA)提取

cDNA合成：从培养的DFM-16和08H植株材料上分别剪取幼嫩叶片，迅速放入液氮中研磨，总RNA提取根据天根RNA提取试剂盒说明书进行，然后用NanoDrop 2000测定提取的RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，以质量检测合格(OD260/280为1.9～2.1，电泳显示2条清晰且无拖尾条带)的RNA为模板，参照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书合成cDNA。

gDNA提取：从培养的DFM-16和08H植株材料上分别剪取幼嫩叶片，迅速放入液氮中研磨，DNA提取按照天根DNA提取试剂盒说明书进行，用NanoDrop 2000检测提取的DNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，提取质量合格的DNA(OD260/280为1.8左右，电泳显示1条清晰条带)用作后续扩增基因序列的模板。

1.4 VtHSP70 cDNA序列及gDNA序列扩增

根据已测定的三色堇HAR材料中HSP70基因序列[12]，利用Primer 5.0设计引物(表2)。PCR扩增体系(20 μL)：cDNA或gDNA模板约为100 ng，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，TaqDNA聚合酶0.5 U，无菌水补足至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，48 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，72 ℃终延伸5 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用TaKaRa凝胶回收试剂盒进行回收。将回收产物连接于pMD18-T载体上，经E.coil感受态细胞转化和蓝白斑筛选后，将重组载体菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。

表2 VtHSP70基因克隆及qRT-PCR分析所用引物序列

1.5 VtHSP70 cDNA序列及gDNA序列分析

测序结果利用Seq Man软件进行拼接。采用NCBI的ORF finder预测开放阅读框(Open reading frame，ORF)，BLAST进行序列同源性比对。从NCBI网站下载其他植物的HSP70序列，利用DNAMAN软件做系统进化树。

1.6 VtHSP70基因表达水平分析

选取DFM-16和08H生长一致且健壮的植株，放在光照培养箱中于42 ℃下分别热激处理0、1、2、6、12 h，每个处理包括5株植株，处理结束后取5株植株的新鲜叶片进行混样，用液氮迅速冷冻，提取样品RNA，反转录为cDNA序列。基于扩增的VtHSP70cDNA序列，设计qRT-PCR引物，选用三色堇β-Actin基因作为内参，引物序列见表2。qRT-PCR反应体系为:TB Green Premix ExTaqⅡ(2×)7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA(10 ng/μL) 1 μL，补超纯水至15 μL。扩增程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后分析产物的荧光值变化曲线和熔解曲线，采用2-ΔΔCT法计算每个样本中目标基因的相对表达水平(ΔΔCT=ΔCT.Gene-ΔCT.Control，其中，ΔCT.Gene为待测组目的基因与内参基因CT的差值，ΔCT.Control为对照组目的基因与内参基因CT的差值)。每个样本设3个技术重复，在同一批次完成目的基因和内参基因的PCR反应。

2 结果与分析

2.1 VtHSP70基因cDNA序列及gDNA序列扩增

以DFM-16和08H材料的cDNA为模板，扩增2个材料中VtHSP70cDNA序列。电泳结果显示，2个材料中VtHSP70cDNA序列大小相同，略大于2 000 bp(图1)。测序结果表明，2个VtHSP70cDNA序列均为2 042 bp，预测ORF都为1 950 bp，推测编码649个氨基酸，序列相似性为98.61%。

以DFM-16和08H材料的DNA为模板，扩增2个材料中VtHSP70gDNA序列。电泳结果显示，2个材料中VtHSP70gDNA序列大小也基本相同，在3 000 bp左右(图1)。测序结果表明，DFM-16中VtHSP70gDNA为2 514 bp，08H中为2 505 bp，序列相似性达到92.19%。cDNA和gDNA序列分析显示，2个基因都含有1个内含子，DFM-16材料中内含子长度为570 bp，位置在218—787 bp，08H材料中内含子长度为561 bp，位置在218—778 bp(图2)。

1.DFM-16 cDNA；2.08H cDNA；3.DFM-16 gDNA；4.08H gDNA

黄色区域为蛋白质编码区，黑色直线为内含子区域，蓝色区域为UTR区

2.2 VtHSP70基因同源比对及系统进化分析

根据预测出的VtHSP70基因编码的氨基酸序列，与拟南芥、水稻和芝麻中HSP70基因编码序列进行比对(图3)，氨基酸相似度分别达到96.26%、95.85%、93.49%。结果表明，三色堇VtHSP70基因与拟南芥的同源性较高，与水稻和芝麻次之。其中，三色堇VtHSP70氨基酸序列C末端含有一段EEVD序列，该序列为胞质HSP70的特征序列，表明本研究分离的VtHSP70基因编码产物可能定位在细胞质中。

在同源比对的基础上，为分析三色堇中VtHSP70的进化关系和分类，选取拟南芥、水稻、芝麻中HSP70家族所有成员，共71个HSP70氨基酸序列构建系统进化树。从亲缘远近来看，2个三色堇材料首先聚类，其次与拟南芥聚类，接着是水稻，最后是芝麻，表明在所选的几种植物中，三色堇与拟南芥亲缘关系最近，与芝麻最远(图4)。并且2个三色堇材料所聚的这类HSP70都属于胞质HSP70，证明2个三色堇材料中的HSP70都定位在细胞质中。

红框内为细胞质中高度保守的HSP70 C末端标志序列EEVD; Vt：三色堇；At：拟南芥；Os：水稻；Si：芝麻

2.3 高温胁迫下VtHSP70基因的表达

42 ℃热激处理后，耐热材料DFM-16在12 h内生长状况良好，形态无明显变化。而热敏材料08H在2 h时叶片开始出现轻微皱缩萎蔫，随着热激时间延长，萎蔫症状加重，至12 h时，严重萎蔫并伴随植株倒伏(图5)。

采用qRT-PCR检测不同热激时间下2种材料中VtHSP70基因的表达水平，以未经热激(0 h)处理的08H材料的样本为对照，经42 ℃热激处理后，2个材料中VtHSP70基因的转录水平在4个处理时间都升高，且在2 h时有最高表达水平，6 h和12 h时表达水平相似，都有所回落，但仍然高于对照水平。比较2个材料中VtHSP70基因表达水平发现，耐热材料DFM-16中VtHSP70基因的表达量在室温和热激处理条件下都高于热敏材料08H，DFM-16材料中最高表达倍数为其0 h的524倍，而08H材料仅为其0 h的36倍(图5)。

星号标记为DFM-16和08H VtHSP70蛋白，弧线标记为定位在胞质的HSP70

图5 不同热激时间下三色堇的表观特征及VtHSP70基因的表达水平

3 结论与讨论

HSP70是HSP家族中非常保守的一类应激蛋白。本研究测定了耐热材料DFM-16和热敏材料08H中VtHSP70的cDNA序列，与拟南芥、水稻和芝麻中HSP70基因编码的氨基酸序列相似性均在90%以上，这与陈曦[13]的研究结果一致，说明VtHSP70基因高度保守。

编码细胞质HSP70的基因通常具有0个或1个内含子，而编码细胞器HSP70的基因具有多个内含子[14]。通过基因结构分析，2个材料中VtHSP70均含有1个内含子，由此推测DFM-16和08H材料中的VtHSP70编码细胞质的HSP70。根据HSP70亚细胞位置，可分成细胞核HSP70、细胞质HSP70、内质网HSP70、线粒体HSP70和叶绿体HSP70。本研究中2个三色堇VtHSP70 氨基酸序列均含有一段胞质HSP70的特征序列EEVD，依据蛋白质序列的结构和功能的相似性，通过系统进化树的聚类，可根据已知的蛋白质特性来推测同一类未知的蛋白质特性[15]。根据2个三色堇材料与拟南芥、水稻和芝麻的氨基酸聚类结果，发现2个材料中的VtHSP70首先与其他植物中的胞质HSP70聚类，进一步说明VtHSP70定位于细胞质中。

大量研究表明，HSP70基因在调控植物抗逆过程中发挥了重要作用，植物在受到不利条件，如高温逆境胁迫时，会上调HSP70的表达量，增强对高温胁迫的抵抗力[16-17]。大部分植物在37～45 ℃的环境下，HSP70基因都会在0.5～2 h后被大量诱导表达[18-19]；拟南芥[20]和小麦幼苗[21]在40 ℃处理1 h时，HSP70基因的表达量均达到最高值，42 ℃处理蜡梅1 h时，CpHSP70基因表达量也达到最高，将近对照的10倍[22]；本研究中，与其他植物相类似，42 ℃热胁迫处理下，DFM-16和08H材料中VtHSP70基因表达量都明显上升，且在1 h就能被诱导，表达模式为随着胁迫时间延长，基因表达水平先升高后降低。推测当高温胁迫时，HSP70基因激活并快速大量表达以维持功能蛋白稳态，但胁迫持续进行使植物体长时间处于亚健康状态时，超越了HSP70维持机体功能蛋白稳态的限度，各种生理功能开始受到影响，HSP70表达量出现下调。但与拟南芥、蜡梅和小麦中研究结果[20-22]不同，三色堇VtHSP70基因在2 h表达量最高，这可能是物种差异，也可能是由于HSP70基因成员不同而出现的差异。在42 ℃热胁迫处理下，08H材料较DFM-16材料对热胁迫的反应更敏感，比较其VtHSP70基因表达水平发现，耐热材料DFM-16中VtHSP70基因的表达量在室温条件和热激处理条件下都明显高于热敏材料08H，DFM-16材料中最高表达倍数达到对照的524倍，而08H材料仅为对照的36倍，表明VtHSP70基因的表达水平可能与三色堇的耐热性呈正相关。这种表达水平上的差异可能与基因的调控区域以及DNA甲基化等有关。