维生素C和黄芪多糖对热应激蛋鸡蛋品质及肠道健康的影响

秦 红 王 帅 陈昱筱 庞治华 王天元 庞全海

(山西农业大学动物科技学院1，太谷 030801)(山西省柳林县穆村镇畜牧兽医站2，吕梁 033300)>(山西省柳林县动物疫病预防控制中心3，吕梁 033300)

热应激可导致畜禽采食量、饮水量减少，生产性能降低，肠道菌群紊乱，消化功能失调等，给蛋鸡产业带来巨大损失[1]，其主要通过氧化应激以及炎症反应等途径导致机体损伤[2]。肠道是机体第一道免疫防线的重要组成部分，通过营养调控手段，提高肠道免疫力已成为解决热应激最有效的办法。维生素C和黄芪多糖(AstragalusPolysaccharides，APS)均有缓解氧化应激的作用[3, 4]。已有研究表明，黄芪多糖除了具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、造血、护肝以及防止动脉硬化的作用外[5]，还具有提高蛋鸡生产性能[6]、增强疫苗免疫效价[7]、抑制腹泻致病菌繁殖的作用[8]。维生素C是可提高动物的抗氧化性，降低氧化应激代谢过程中所产生的自由基，提高生产性能及免疫力[9]。目前虽然已有大量黄芪多糖和维生素C单独在饲料中的应用研究，但主要集中于蛋鸡的生产性能、蛋品质、血清抗氧化性等，对肠道免疫研究较少。本实验以蛋鸡为对象，通过在饲料中添加黄芪多糖和维生素C，研究其对蛋鸡生产性能、蛋品质、肠道形态结构、肠黏膜抗氧化性及相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验设计

采用单因子实验设计，144只40周龄海兰褐蛋鸡随机分为3个处理组，每组4个重复，每个重复12只鸡，对照组饲喂基础饲粮，黄芪多糖组饲喂基础饲粮+0.5 g/kg黄芪多糖，维生素C组饲喂基础饲粮+0.2 g/kg维生素C。蛋鸡置于(33±2) ℃的热应激环境中，预试期1周，正试期28 d，基础饲粮为干粉料，参照NRC(1994)蛋鸡营养需要配制基础饲粮，饲粮组成及营养成分见表1。实验采用三层阶梯笼养，每笼3只，各重复均匀分布于鸡舍，自然光与人工补光相结合，每天光照时间16 h。自由采食和饮水，每天喂料、收蛋各2次，按常规程序进行鸡只免疫和栏舍消毒。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

注：维生素预混料为每千克饲料提供：维生素A 8 000 IU，维生素D 2 500 IU，维生素E 10 IU，维生素B10.8 mg，维生素B22.5 mg，维生素B61.5 mg，维生素B120.004 mg，烟酸 20 mg，叶酸 0.25 mg，泛酸钙 18mg，生物素0.1 mg。矿物质预混料为每千克饲料提供：Cu 8 mg，Fe 60 mg，Mn 60 mg，Zn 80 mg，I 0.4 mg，Se 0.3 mg。营养水平为计算值。

1.2 实验材料

维生素C，添加量为0.2 g/kg。

黄芪多糖，其黄芪多糖成分是总量的70%，添加量为0.5 g/kg。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 蛋鸡生产性能

实验期间每天定时记录各重复产蛋总数、总蛋重和破蛋数，并统计采食量，以重复为单位每周统计各组产蛋率、平均日采食量、平均日产蛋量、平均蛋重和料蛋比。

1.3.2 鸡蛋品质

实验期第28天，分别从每组随机抽取12枚鸡蛋(4枚/重复)用于测定蛋品质指标。蛋壳强度测定仪测定蛋壳强度；蛋壳厚度测定仪测定蛋壳厚度；多功能蛋品质分析仪测定蛋白高度、哈夫单位和蛋黄颜色。

1.3.3 肠道抗氧化能力

取十二指肠、空肠、回肠中段，测定前制备成10%的组织匀浆并吸取上清保存于-80 ℃，采用抗氧化试剂盒测定上清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性，上清液蛋白质含量采用BCA试剂盒测定。

1.3.4 肠道形态

无菌剪取十二指肠、空肠、回肠段各0.5 cm，生理盐水冲洗后，4%多聚甲醛进行固定，4 ℃保存24 h，自来水冲洗后经梯度酒精脱水、二甲苯脱酒精，石蜡包埋后切成5 μm切片，常规HE染色，每个样品观察2张非连续的切片，每张切片选取5个典型的视野，用光学显微镜进行观察测量，测定相应的绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度与隐窝深度的比值(绒腺比)。

1.3.5 蛋鸡肠道及子宫相关基因表达量的测定

采用Trizol法提取肠道及蛋壳腺组织RNA。测定RNA完整性、浓度和纯度后，使用反转录试剂盒合成cDNA，-20 ℃保存备用。以cDNA为模板, 采用荧光定量PCR技术检测相关基因，在200 μL的PCR薄壁管中建立PCR反应体系。反应体系20 μL，为cDNA 2.5 μL、上下引物各0.6 μL、EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL、6.3μL ddH2O。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。根据目的基因和内参基因β-肌动蛋白(β-actin)阈值循环(CT)，采用2-△△CT法计算样品中各目的基因mRNA的相对表达量。引物由上海生工合成，序列见表2。

表2 引物序列信息

1.4 数据统计与分析

运用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way-ANOVA)，以Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，0.05

2 结果

2.1 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡生产性能的影响

由表3可知，各处理组产蛋率、平均蛋重、日产蛋重、日采食量及料蛋比均差异不显著(P>0.05)。

表3 黄芪多糖和维生素C对生产性能的影响

注：同行肩注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，余同。

2.2 黄芪多糖和维生素C对蛋品质及蛋壳腺相关基因的影响

2.2.1 黄芪多糖和维生素C对蛋品质的影响

由表4可知，与对照组相比，维生素C组蛋壳强度极显著提高(P<0.01)，黄芪多糖组蛋壳强度显著提高(P<0.05)。

2.2.2 黄芪多糖和维生素C对蛋壳腺相关基因的影响

如图1所示，与对照组相比，添加维生素C后，蛋壳腺组织中CA(P<0.01)以及OP(P<0.05)mRNA的相对表达量均极显著或显著提高。

图1 维生素C和黄芪多糖对蛋鸡蛋壳腺相关基因的影响

2.3 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡肠道抗氧化酶活性及相关基因表达的影响

2.3.1 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡肠道抗氧化酶活性的影响

由表5可知，与对照组相比，维生素C组十二指肠、空肠、回肠MDA含量显著降低(P<0.05)，黄芪多糖组空、回肠MDA含量显著降低(P<0.05)。饲粮中添加维生素C极显著提高十二指肠SOD活性(P<0.01)，添加黄芪多糖可极显著提高十二指肠SOD活性(P<0.01)、显著提高空、回肠SOD活性(P<0.05)。维生素C组和黄芪多糖组均极显著提高十二指肠、空肠、回肠CAT及GSH-PX活性(P<0.01)。

表5 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡肠道抗氧化性的影响

2.3.2 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡肠道抗氧化酶相关基因表达的影响

由图2可知，与对照组相比，维生素C显著提高十二指肠CAT、SOD1基因相对表达量(P<0.05)，显著提高回肠OH-1 mRNA相对表达量(P<0.05)。添加黄芪多糖可提高十二指肠(P<0.05)、空肠(P<0.01)及回肠(P<0.05)CAT基因相对表达量，提高十二指肠(P<0.01)、空肠(P<0.01)及回肠(P<0.05)组织中OH-1 mRNA相对表达量，提高十二指肠、空肠以及回肠中SOD1 mRNA相对表达量(P<0.01)。而维生素C和黄芪多糖均对SOD2 mRNA表达没有显著影响。

图2 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡肠道抗氧化酶相关基因CAT、OH-1、SOD1、SOD2基因表达的影响

2.4 黄芪多糖和维生素C对蛋鸡肠道形态的影响

由图3可知，与对照组相比，添加维生素C和黄芪多糖可极显著升高十二指肠、回肠的绒毛高度(P<0.01)，显著升高空肠绒毛高度(P<0.01)。其中黄芪多糖极显著降低各肠段的隐窝深度(P<0.01)，极显著增加绒腺比(P<0.01)。维生素C组十二指肠、回肠绒腺比极显著增加(P<0.01)。

图3 维生素C和黄芪多糖对蛋鸡肠道形态的影响

3 讨论

热应激对蛋鸡生产性能有较大危害，会导致蛋鸡产蛋率、蛋重下降，其导致的采食量减少是影响蛋鸡生产性能的主要因素之一[1]，而采食量下降会抑制功能性卵巢活动，导致卵泡生长受阻并抑制排卵物质的分泌[10]。研究表明，黄芪多糖可显著提高蛋鸡生产性能，提高饲料报酬，并减缓由氧化应激所引起的线粒体功能障碍[6, 11]。李树文等[12]研究表明，维生素C具有提高热应激蛋鸡采食量、产蛋数及产蛋率的作用。在本实验中，添加黄芪多糖和维生素C后对热应激蛋鸡的生产性能未见明显影响，因此，通过检测肠道抗氧化性、肠道形态、蛋品质及影响蛋品质的相关基因进一步说明其影响。

3.1 黄芪多糖和维生素C对蛋品质及蛋壳腺相关基因的影响

蛋品质主要由蛋白高度、蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、哈氏单位和蛋黄颜色等指标来综合判断。热应激可降低蛋壳厚度及蛋壳强度，增加破损蛋率，影响蛋鸡养殖效益[13]。而蛋鸡饲粮中添加适量黄芪多糖和维生素C均有改善蛋品质的作用[3, 4]。本研究发现，日粮中添加黄芪多糖和维生素C后其蛋壳强度分别显著、极显著高于对照组，与前人结果基本一致，说明黄芪多糖和维生素C有改善热应激蛋鸡蛋壳品质的作用。

蛋壳腺是蛋壳形成的重要部位，钙离子转运至壳腺腔后沉积形成蛋壳，因此蛋壳腺在钙离子跨细胞转运中发挥重要作用[14]。黄芪多糖和维生素C均有改善热应激蛋鸡蛋壳品质的作用，但其作用的具体机制未知。因此，进一步研究2种添加剂对蛋壳腺的影响，观察其是否通过影响钙离子的沉积进而蛋壳品质。碳酸酐酶(CA)具有催化H2CO3分解，促进CaCO3生成的作用[15]。Ma等[16]研究表明，热应激可降低蛋鸭蛋壳腺中CA mRNA的相对表达量。骨桥蛋白(OPN)是一种磷酸化的细胞外基质蛋白，在多种组织(骨、蛋壳腺等)中存在，参与Ca2+转运，若该蛋白基因表达减少，会给蛋壳钙化带来缺陷[15]。饲粮中添加维生素C可提高蛋壳腺CA和OPN的相对表达量，说明维生素C通过提高CA和OPN的相对表达量进而影响蛋壳品质。

3.2 维生素C和黄芪多糖对蛋鸡肠道抗氧化能力及抗氧化基因的影响

胃肠道是生物体与腔内容物之间的重要连接，亦是热应激损伤的敏感部位，热应激可改变机体抗氧化功能，诱发氧化胁迫，致使体内产生大量自由基，发生氧化应激，进而导致肠黏膜缺血缺氧性损伤，引起肠源性感染[17]。GPX、CAT、SOD活性和MDA含量是反映机体抗氧化功能的重要指标。其中，MDA是反映ROS增加的一个重要参数，ROS过量导致脂质过氧化及氧化应激。GPX、CAT、SOD等亦发挥着重要作用，其中SOD将超氧自由基转化为H2O2和O2，随后GPX、CAT独立地将H2O2转化为H2O和O2[18]。因此，提高蛋鸡肠道抗氧化酶活性，降低MDA含量，与蛋鸡健康密切相关。

抗氧化酶基因表达量的增加亦是导致酶活增加的重要原因[23]。本实验从转录水平考察了维生素C和黄芪多糖是否对抗氧化酶基因的表达产生影响。结果显示，饲粮中添加维生素C和黄芪多糖均可不同程度地提高肠道SOD1、CAT、OH-1基因表达水平，说明维生素C和黄芪多糖均具有促进小肠SOD1、CAT、OH-1基因表达的功能，进而提高了蛋鸡肠道的抗氧化性。但维生素C和黄芪多糖均对SOD2 mRNA相对表达量没有明显的促进作用，这可能是由于维生素C和黄芪多糖主要通过刺激SOD1影响SOD的活性。马春阳[24]实验结果表明抗氧化活性的提高与抗氧化基因的表达呈正相关。本实验中，小肠组织中抗氧化性基因表达量的上调和组织中相应酶活性的增加的结果一致，进一步验证前人的结论。结合肠道抗氧化性能的数据后发现，黄芪多糖组抗氧化基因的相对表达量均高于各处理组，表明添加黄芪多糖更有力于提高蛋鸡的肠道抗氧化能力。

3.3 维生素C和黄芪多糖对蛋鸡肠道形态的影响

肠道是机体中重要的器官之一，在消化、吸收以及免疫防御中起着重要的作用。绒毛高度和隐窝深度可作为判断成熟黏膜上皮细胞数量的指标，小肠绒毛高度与机体吸收能力成正相关，而隐窝深度增加导致消化功能减弱[25]。研究表明，肠道极易受到热应激的影响而产生大量自由基并通过脂质过氧化作用损害肠道细胞结构导致绒毛高度降低，隐窝深度变深，绒隐比降低[26]。因此，干预脂质过氧化对维持肠道形态具有十分重要的作用，而维生素C和黄芪多糖均具有干预脂质过氧化的作用。李世召[27]研究表明，鸡胚给养维生素C提高了42 d肉鸡十二指肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度。雷新宇[28]研究表明，日粮添加1%黄芪多糖显著降低种公鸡十二指肠隐窝深度，并提高空肠绒毛高度/隐窝深度比值。本实验中，添加维生素C和黄芪多糖在一定程度上均提高肠道绒毛高度。相较于对照组，黄芪多糖更有效地降低了各肠段的隐窝深度，说明维生素C和黄芪多糖均具有维持肠道形态的作用，而添加黄芪多糖对肠道形态的作用更明显。这可能是由于黄芪多糖除抗氧化作用外，还可通过促进紧密连接蛋白的表达调节肠上皮细胞间的通透性，更有益于肠道形态的维持[28]。

4 结论

维生素C和黄芪多糖均可通过提高肠道抗氧化基因的表达改善抗氧化能力，维持肠道的正常形态，且黄芪多糖的作用优于维生素C。维生素C可通过提高蛋壳腺组织中CA及OP mRNA的相对表达量改善蛋壳强度。维生素C和黄芪多糖对于蛋鸡的生长性能均未见明显影响。