稻米中无机砷检测关键因素研究及方法建立

周明慧 陈 曦 张洁琼 伍燕湘 王松雪

(国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037)

砷(As) 是自然界中普遍存在的非金属元素，具有多种形态，砷在生物体内的毒性大小与砷赋存的化学形态密切相关，其中，毒性较大的是无机砷(iAs)[1,2]，已被国际癌症研究机构(IARC)列为I级人类致癌物。大米是我国大部分地区，特别是南方居民一日三餐的主食来源，相比玉米和小麦等其他粮食作物，水稻因其特殊的生长环境具有更强的砷富集能力，研究显示稻谷中砷主要以无机砷和二甲基砷的形态存在[3]，稻谷消费已成为我国居民对无机砷最主要的暴露途径[4,5]，因此我国食品安全国家标准早在2005年就对稻米中无机砷进行了限量要求，并于2017年制定了大米中无机砷国际限量标准[6]。鉴于暴露风险与监管要求，大米中无机砷的快速精准检测技术成为标准制定和方法研究的热点。

根据文献报道，对于稻米中砷形态的提取，一般采用加入溶剂并借助一些辅助手段来提取样品中不同形态的砷，主要的提取试剂可以分为无机试剂、有机试剂和生化酶类[7-9]，常用的提取方法有微波消解、超声提取、加热提取和超声探针提取等[10-13]。Zheng等[14]的研究发现，有机提取剂中的甲醇有利于有机砷的提取，但会降低无机砷的萃取效率。生化酶类可以避免砷形态之间的转化，同时降低共提取物的干扰，但是成本较高，操作复杂繁琐，且有的水解酶不易得到。硝酸作为一种常用的无机提取剂，提取效率较高，目前稀酸加热法广泛应用于食品中无机砷的提取，同时也是GB 5009.11—2014《食品中总砷及无机砷的测定》[15]中规定的稻米样品无机砷测定的试样提取方法。通过对不同样品测试发现，使用稀酸加热法对稻米样品进行前处理，样品的粒径、温度以及加热方法，均是影响提取效率的关键因素。另外，热浸提法耗时长，易造成砷化合物形态的转化和损失，而且过程中的振摇受人为因素影响大。为此，以实际大米样品为研究对象，对稻米中无机砷的测定的关键影响因素进行系统研究，并建立微波消解-LC-AFS联用方法对稻米中无机砷进行精准检测，为稻米中无机砷的提取效率和测定效率及精准性以及大米中无机砷的快速精准检测提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 仪器与试剂

BAS-100A型液相色谱-原子荧光联用仪(配有砷空心阴极灯)；Mars微波消解仪；NOVA-2S单模微波消解仪；PRP-X100阴离子交换柱(250×4.1 mm，10 μm，配有保护柱)；H1650型台式高速离心机；Milli-Q超纯水处理系统；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱；Mettler pH计。

砷标准物质：GBW08666亚砷酸根溶液、GBW08667砷酸根溶液、GBW08668一甲基砷溶液、GBW08669二甲基砷溶液、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、氨水(色谱纯)；硼氢化钾、氢氧化钾、硝酸、盐酸(优级纯)。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

用0.15 mol/L HNO3溶液分别将4种砷形态溶液标准物质经多次稀释配制质量浓度分别为2、5、10、20和25 ng/mL的混合标准使用液。

1.2.2 仪器条件

液相色谱条件：流动相为15 mmol/L (NH4)2HPO4，pH=6.0；梯度流速为0～2 min：1 mL/min，2～6 min：0.7 mL/min，6-12 min：1 mL/min；进样量为100 μL。

原子荧光条件：负高压：285V；砷灯总电流：80 mA；主电流/辅助电流：40/40；载流：15% HCl溶液；还原剂：2% KBH4+0.5%KOH溶液；载气流速：500 mL/min；辅助气流速：1 000 mL/min；原子化器温度：200 ℃。

1.2.3 样品前处理

称取经研磨后粒径为0.38 mm的大米粉样品0.5 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入7.5 mL 0.15 mol/L HNO3溶液，微波消解程序如表1所示。待提取液冷却至室温后于8 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm有机系滤膜过滤后进样测定。

表1 微波消解辅助提取程序

2 结果与讨论

2.1 大米中无机砷检测的影响因素

2.1.1 样品粒径的控制

样品粒径决定其表面积大小，样品与提取液的接触面积越大，越有利于无机砷的提取[16]，可见样品粒径对于提取效率至关重要。以GB 5009.11—2014的提取方法对不同粒径样品进行前处理，提取液的测试结果由图1可见，不论是糙米还是大米，随着样品粒径增大，无机砷的检测结果逐渐降低，由此可知，该方法并不能对粒径大于0.15 mm的样品进行有效提取，同样的结果在对不同粒径的标准物质进行测试中也可进一步被证明(表2)，粒径较大的GBW(E)080684a可测砷形态的总和明显低于总砷的定值。一般规格的研磨仪仅能将大米样品粉碎至粒径为0.25 mm，要将样品粉碎至粒径小于0.25 mm较难实现，所以，需要选择更为高效的前处理方式。

图1 样品粒径对无机砷检测结果的影响

2.1.2 前处理方法的选择

本研究采用粒径为0.15 mm的大米粉样品，分别考察了振荡、超声和微波等常见辅助提取方式对于稻米中不同砷形态提取效果的影响，结果如图2所示。图2中揭示的稻米样品中存在的3种主要的砷形态中，AsⅢ最难被提取，同时进一步说明寻找更为有效的提取方式的必要性。室温条件下，振荡0.5～2.5 h均不能有效地提取样品中的AsⅢ。同时，在60 ℃条件下，超声辅助提取2.5 h不能完全将样品中的无机砷提取出来。而微波辅助提取可在短时间内提取细粒径的标准物质中的无机砷，相比其他方式具有明显的优势，这也是国际上广泛采用的无机砷测定样品前处理方法[17-19]。

表2 GB 5009.11—2014方法对于标准物质的提取率

图2 不同前处理方法对不同砷形态提取效率的影响

2.1.3 温度对于提取的影响

提取温度对于无机砷的精准测定至关重要，既要完全提取稻米中的无机砷，又要保证样品中的砷形态不发生改变。借助可精准稳定控温的单模微波消解技术，考察标准溶液和样品中的无机砷在不同提取温度下的稳定性，结果如图3所示。温度在低于110 ℃时，图3a中AsⅢ的提取效率上升较为明显，温度达到110 ℃后，提取率随温度升高呈现缓慢上升趋势；而图3b中AsV则随温度的提高没有明显变化，但可观察到在高温范围内有缓慢的下降趋势，初步推论2种不同价态的无机砷在高温下有微量的转化[20]；图3c则证实了该推断，温度达到110 ℃后，无机砷总量无明显变化，并且不同砷形态加和与总砷定值或者测定结果一致，证实此温度下无机砷被有效提取出来，由标准溶液测试结果可知，无机砷并未向有机砷转换，而实际样品测试结果也显示，有机砷形态也并未向无机砷形态发生转换。

2.1.4 微波辅助提取升温条件的影响

以测定的粗粒径样品中不同砷形态结果之和与总砷定值进行对比，选择微波辅助提取升温方式，如图4所示。采用110 ℃，30 min的非梯度升温方式，样品中总砷提取结果明显低于定值，而采用如表1所示的梯度升温方式进行微波辅助提取，由于在低温条件下，样品可与提取试剂充分混合，提高了高温环节的提取效率，可实现不同粒径样品中不同砷形态在30 min被完全提取。

图4 升温程序对于提取效率的影响

2.1.5 提取液酸度对于测定的影响

GB 5009.11—2014中规定不同砷形态标准溶液以纯水配制，本研究重复了该方法对于不同砷形态组分的完全分离，如图5所示；而样品中无机砷使用酸度较大的0.15 mol/L的HNO3溶液进行提取，会对色谱柱内环境pH产生影响，尤其是对于LC-AFS法[21,22]，由于进样量多达100 μL，影响更加明显，而阴离子交换柱的分离效果受pH影响较大，从而导致AsⅢ和DMA无法完全分离，见图6。

图5 纯水配制标准溶液的砷形态分离谱图(10 ng/mL)

图6 0.15 mol/L HNO3溶液提取大米样品的砷形态分离谱图

为解决大米样品提取液酸度对色谱分离带来的影响，根据不同砷形态分离的需求调整国标中恒定流速为1.2.2所述梯度流速，在保证AsⅢ和DMA能得到完全分离的情况下检测时间不会延长过多，符合批量样品检测需求(图7)。

图7 10 ng/mL混合标准溶液的梯度流速洗脱色谱图(磷酸二氢铵)

2.1.6 流动相的选择

梯度流速下无机砷的测定需要14 min(图7)，同时待测物AsV的峰面积响应较低，为进一步提升检测效率和灵敏度，在相同的pH和梯度流速条件下，本研究优化出15 mmol/L(NH4)2HPO4作为流动相，缩短检测时间至10 min且显著增加了AsV的峰面积(图8)。

图8 10 ng/mL混合标准溶液的梯度流速洗脱色谱图(磷酸氢二铵)

2.2 方法学评价

基于对稻米中无机砷分析关键影响因素的分析和控制，优化建立了微波辅助提取-LC-AFS测定大米中无机砷的方法。

2.2.1 线性方程和检出限

以LC-AFS色谱峰信噪比S/N为3:1时所对应的浓度计算方法检出限，同时在2～25 μg/L范围内对标准曲线的线性相关系数进行考察。如表3所示，2种无机砷形态标准系列线性关系良好，检出限满足检测需求。

表3 线性关系和检出限

2.2.2 准确度和精密度

为了进一步考察本方法的准确性，采用不同粒径的标准物质及实际样品进行测定，如表4所示。所测样品中不同砷形态结果加和与总砷的标准值全部一致。

表4 方法准确度/mg/kg

选取GBW(E)080684a大米粉成分分析标准物质，平行测定6次，无机砷的相对标准偏差为2.25%，方法精密度良好。

3 结论

对稻米粒径、提取温度、提取方式以及液相分离条件进行优化，建立了微波消解-液相色谱-原子荧光光谱联用方法精准快速测定稻米中的无机砷，从前处理和检测两个方面提高粗粒径样品中无机砷的检测效率和检测精准性。AsШ和AsⅤ的方法检出限分别为0.026和0.047 ng/mL，满足GB 2762—2017《食品中污染物限量》中规定稻谷、糙米和大米中无机砷限量为0.2 mg/kg的要求，同时可快速并准确分析待测样品，适用于批量大米样品无机砷的测定。