一种快速检测单增李斯特菌的双重PCR方法

王昊宇

【摘 要】探讨检测新鲜海螺样品中单增李斯特菌的双重PCR快速检测方法。基于单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因分别合成两对引物，对影响PCR的主要因素进行优化，最终确定同时检测单增李斯特菌两个特异性基因的双重PCR最佳反应体系及条件，该方法对于纯培养物的最低检出限为102CFU/mL，模拟污染海螺样品的检测限为8CFU/g。

【关键词】单增李斯特菌；双重PCR；海螺样品

【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）01-0225-02

本工作将单增李斯特菌最重要的毒力因子-编码溶血素的hlyA基因，与李斯特菌属16sRNA基因同时作为单增李斯特菌的检测指标，将双重PCR方法与选择性增菌法相结合，旨在建立一种快速灵敏检测单增李斯特菌的双重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

单增李斯特菌标准株由省疾病预防控制中心提供；大肠杆菌（Escherichia coil）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）和伤寒杆菌（Salmonella typhi）为本实验室保存菌株。

1.1.2 试剂

李斯特氏菌显色培养基、单增李斯特菌成套生化鉴定管、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）、李氏增菌肉汤LB1、萘啶酮酸、吖啶黄素 青岛高科园海博生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA以及PCR相关试剂 北京天根生化有限公司。

1.1.3 引物序列

根据文献[1]以单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因作为靶基因分别合成两对特异性引物，所用引物序列见表一，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 仪器

VersaDoc凝胶成像仪 美国伯乐；PCR扩增仪 美国伯乐；……