安宫牛黄丸对大鼠急性脑缺血再灌注MMP9、AQP4表达的影响

李继中，江 艳，曾 艳，颜小庚，颜俊文

(1.遵义医科大学第五附属(珠海)医院 神经内科，广东 珠海 519100；2.遵义医科大学第五附属(珠海)医院 肾内科，广东 珠海 519100；3.遵义医科大学第五附属(珠海)医院 新生儿科， 广东 珠海 519100)；4.遵义医科大学第一附属医院 药剂科，贵州 遵义 563099)

脑卒中已经成为我国疾病谱中第一大死亡原因，而缺血性脑血管病变占脑卒中的绝大部分(70%～80%)。血液中的各种栓子(如动脉粥样硬化斑块、心脏内的附壁血栓、脂肪栓子等)随血液进入脑动脉而导致脑内的血管出现部分或完全阻塞，当侧支循环不能代偿时，引起该动脉供血区脑组织缺血性坏死，出现局灶性神经功能缺损，如肢体偏瘫、言语障碍、吞咽困难等。具有高发病率、高致残率、高死亡率的特征，严重影响患者生存质量。安宫牛黄丸是我国传统医药精品，具有清热解毒、镇惊开窍等功效。主要用于神昏谵语，中风昏迷及脑炎、脑出血等疾病[1]，其治疗机制尚不明确。本研究旨在探讨安宫牛黄丸对急性脑缺血再灌注大鼠脑保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康清洁级SD大鼠50只，平均体重(230±20)g，购自山东省实验动物中心，生产许可证号：SCXK(鲁)20140007。实验动物的饲养环境(光照12 h/黑夜12 h，湿度50%左右，温度24 ℃左右)。

1.2 药品和试剂 安宫牛黄丸购自北京同仁堂公司；MCAO栓线购自北京沙东生物公司，红四氮唑(分析纯)购自上海山浦化工有限公司。

1.3 仪器 电子分析天平：北京赛多利斯电子天平有限公司；MILLI-Q超纯水纯化系统：Millipore Trading Co.ltd；实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪：美国BIO-RAD公司。

1.4 动物分组及给药 50只SD大鼠随机分成5组：假手术组(假手术+给予1 mL蒸馏水)、模型组(造模+给予1mL蒸馏水)、安宫牛黄丸低剂量组(造模+给予安宫牛黄丸1.0 g/kg)、安宫牛黄丸中剂量组(造模+给予安宫牛黄丸2.0 g/kg)、安宫牛黄丸高剂量组(造模+给予安宫牛黄丸3.0 g/kg)；连续灌胃给药4 d后手术制作脑缺血再灌注动物模型，造模成功后连续予以灌胃给药2 d。

1.5 实验动物模型制作 SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)麻醉，随后将麻醉好的大鼠固定在木板上，用碘伏消毒手术周围皮肤，用手术刀在颈前中间稍偏右切开皮肤，改用止血钳继续往下钝性分离皮下组织，肌肉，暴露右侧颈总动脉，继续向远心端分离，显露颈内、颈外动脉分叉部，在动总动脉、颈外动脉下放置丝线，将颈总动脉近心端和颈外动脉分别结扎，使用动脉夹将颈内动脉夹闭，用小眼科剪刀在颈总动脉与颈内动脉之间剪开一个小口，从小切口往里缓慢插入MACO线，阻断大脑中动脉(长度为：以颈内动脉和外动脉的交叉处作为标志，往远心端插入约2.0 cm)，阻断1 h后将MACO往外拔出约1 cm并剪断，将大鼠放回鼠笼中继续饲养。

1.6 神经功能评分 大鼠手术后48 h, 根据其行为及瘫痪情况进行评分(评分方法参照文献1)，共分为6 个等级(0～5分)。0：大鼠完全正常；1：左前肢不能完全伸直；2：左前肢行走偏向左侧; 3：向左侧旋转行走;4：原地左旋; 5：左侧肢体不能活动。

1.7 测定脑梗死体积 手术后48 h相继断颈法处死大鼠，立即剥离出完整大脑，放入-20℃冰柜冰冻约18 min，将冰冻过的大脑取出后用薄刀片冠状平均切成5张薄片，每片厚度约3 mm，轻轻放入玻璃平皿中(玻璃平皿事先盛有1%TTC溶液)，随后放置烤箱中37℃孵育约30 min(每隔5分钟翻转一次)，梗死区呈白色，非梗死区被染成鲜红色。染色稳定后，倒掉TTC溶液，用生理盐水漂洗2次，弃去，加入10%甲醛溶液，固定24 h后照相，利用多田公式[体积=π/6×长(cm)×宽(cm)×高(cm)]计算脑梗死体积。

1.8 脑组织含水量 处死大鼠后取大脑，置于电子分析天平上称湿重，随后放在玻璃瓶中，置烤箱中烘干至恒重，电子分析天平上称干重。脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.9 RT-PCR测定脑组织MMP9 mRNA、AQP4 mRNA的表达 取梗死区域脑组织50 mg左右加1.0 mL trizol液，参照trizol说明书提取RNA，纯化并测定浓度合格后逆转录，随后加样置于实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪进行PCR扩增，AQP4 的 正 向 引 物 序 列 为 5’-GTGCTAGGAAACTGATATG-3’，反向引物序列为 5’-TCTGGTGTAGTACATTCAA-3’。MMP9 的 正 向 引 物 序 列 为 5’-CAATCCTTGCAATGTGGATG-3’，反向引物序列为 5’-CAATACCGACCGTCCTTGAA -3’。反应条件(预变性95 ℃10 min ,50 ℃ 2 min ；PCR反应95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min 40 Cycles)，采用2ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 安宫牛黄丸可以降低神经功能评分 与假手术组相比较，模型组的评分增高明显(P<0.05)，表明实验动物模型制作成功；与模型组相比较，安宫牛黄丸各组均降低神经功能评分(P<0.05)，与模型组比较，低、中、高剂量组均有统计学意义，表明安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤有保护作用(见表1)。

组别神经功能评分假手术 0模型 4.5±1.2#安宫牛黄丸低剂量 2.8±1.0∗安宫牛黄丸中剂量 2.4±1.1∗安宫牛黄丸高剂量 2.6±1.3∗

#：与假手术组比较,P<0.05;*：与模型组比较,P<0.05。

2.2 安宫牛黄丸可以减少脑梗死体积 各组大鼠脑梗死切片情况见图1。与假手术组相比较，模型组梗死体积较大(P<0.05)，表明模型成功；与模型组相比，安宫牛黄丸组均能减少脑梗死体积(P<0.05)，表明安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤均有保护作用，以中剂量组效果更佳(见表2)。

A：假手术组；B：模型组；C：安宫牛黄丸低剂量组；D：安宫牛黄丸中剂量组；E：安宫牛黄丸高剂量组。图1 1%TTC 染色后的大鼠脑组织切片

组别脑梗死体积(cm3)假手术 0模型 0.130±0.016#安宫牛黄丸低剂量 0.080±0.014∗安宫牛黄丸中剂量 0.076±0.018∗安宫牛黄丸高剂量 0.079±0.020∗

#：与假手术组比较,P<0.05;*：与模型组比较,P<0.05。

2.3 安宫牛黄丸可以减轻梗死周围脑水肿 从表3结果可以看出，大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿情况中，与模型组相比，安宫牛黄丸组均能减轻脑水肿(P<0.05)，减轻脑水肿效果：中剂量组>高剂量组>低剂量组。

组别脑组织含水量(%)假手术 0模型 84±1.21#安宫牛黄丸低剂量 78±1.30∗安宫牛黄丸中剂量 76±0.98∗安宫牛黄丸高剂量 77±0.87∗

#：与假手术组比较,P<0.05；*：与模型组比较,P<0.05。

2.4 梗死区脑组织MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表达 各组大鼠脑组织MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表达情况见表4。与假手术组相比较，模型组MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表达量较高(P<0.05)，表明模型成功；与模型组相比，安宫牛黄丸组均能减少脑组织MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表达(P<0.05)，表明安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤均有保护作用(见表4)。

组别MMP9 mRNAAQP4 mRNA假手术 0.05±0.010.65±0.11模型 0.18±0.02#1.52±0.23#安宫牛黄丸低剂量 0.12±0.02∗0.93±0.18∗安宫牛黄丸中剂量 0.08±0.01∗0.85±0.15∗安宫牛黄丸高剂量 0.09±0.01∗0.89±0.20∗

#：与假手术组比较P<0.05； *：与模型组比较,P<0.05。

3 讨论

脑梗死治疗关键是尽快恢复血供，方法有静脉溶栓或介入治疗等，而据大样本临床观察，血管再通后很大一部分患者并没有因此而得到更好的恢复，主要原因就是缺血再灌注使脑组织损伤进一步加重，如何降低脑缺血再灌注损伤成为目前亟待解决的问题。

血脑屏障(Blood brain barrier ，BBB)的完整性有效的保护了脑组织免受破坏，而在缺血缺氧情况下，BBB遭到破坏，导致早期出现细胞毒性脑水肿，随后出现轻度血管源性脑水肿，进而加重脑梗死患者的病情，从而加速患者死亡[2]，MMP9作为基质金属蛋白酶家族成员中最重要的一员，参与了BBB破坏过程，在缺血缺氧和炎症刺激下，MMP9被大量分泌和激活，直接降解BBB的神经血管基底层和紧密连接蛋白，导致BBB破坏[3-5]；与此同时，AQP4作为中枢神经系统重要的双向转运水分子的选择性水通道蛋白，参与了脑水肿的发展和消退，当AQP4表达上调时，可引起神经胶质细胞足突水肿，进而使BBB 遭到破坏，导致脑水肿[6-9]。当BBB破坏后，脑组织出现大量炎性细胞浸润、血管内皮细胞肿胀，神经胶质细胞及细胞间隙水肿，脑组织水分进一步增加，从而使神经元坏死[10]。

在本实验中，SD大鼠脑缺血1 h再灌注48 h后，MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表达显著增高，激活了BBB的破坏过程，安宫牛黄丸治疗组中，脑梗死体积明显降低、神经功能评分明显改善、脑水肿程度也较模型组减轻，可能与安宫牛黄丸降低MMP9及AQP4 有关。

安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其保护作用可能与其抑制MMP9 mRNA、AQP4 mRNA的表达有关。