赣南脐橙生长发育期果实和叶片抗氧化酶生理调控机制

王小玲 幸学俊 高 柱,2 杜建华

( 1. 江西省科学院生物资源研究所，江西 南昌 330096；2. 江西农业大学园林与艺术学院，江西 南昌 330045；3. 南昌工学院，江西 南昌 330108)

脐橙属于耐阴性较强的果树，对温度的要求较高，适宜的生长温度为23～33 ℃[1]。赣南是我国重要的脐橙生产基地，纽荷尔脐橙（Citrus sinensis‘Newhall'）闻名遐迩[2]。赣南属典型的亚热带湿润气候，平均气温高于国内外脐橙产区，7—9月，受西太平洋副热带高压或大陆高压控制，多为连续晴热天气，降水分配不均，气温高，蒸发大，因此每年都有不同程度的干旱发生，使脐橙生产受到严重危害。

正常情况下，植物通过抗氧化酶和抗氧化剂系统维持细胞内活性氧（ROS）产生与清除的动态平衡[3-4]。逆境（干旱、水淹、高温、低温等）条件下会产生超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（-OH）、单线态氧（1O2）、过氧化氢（H2O2）及脂类过氧化物等具有活泼化学性质的ROS，当细胞内ROS的产生和积累速度大于抗氧化系统的清除速度时，细胞内ROS大量积累，破坏膜系统的完整性和流动性，影响植物生长发育[5]。Foyer等[6]研究也证明，植物是通过提高自身高效的抗氧化酶和抗氧化剂系统来维持体内ROS的动态平衡。可见，要提高高温引起的赣南脐橙的抗干旱能力，就需要提高其抗氧化能力。为此，本试验以纽荷尔脐橙为材料，研究不同生长时期，果实和叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）5种抗氧化酶活性的变化情况，探讨脐橙抗氧化酶系统的氧化保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在江西省赣州市信丰县龙舌村（东经115°00′27″，北纬 25°23′44″，海拔 181.7 m）脐橙园进行，脐橙园土壤营养元素见表1。

表1 脐橙园土壤营养元素Table 1 Soil nutrients in navel orange orchard mg/kg

1.2 试材取样及处理

选取10年生生长健康、结果稳定的纽荷尔脐橙30株为试材，按照完全随机区组设计每小区10株，3次重复。分别于7—11月每月20日9：00晴天采样（如遇阴雨天气提前或延后1～2 d），自样株树冠外围结果枝中上部的4个方向采取健康果（外观颜色和果实大小相当）8～10个，自植株树冠外围中上部新梢中部的4个方向采取健康叶片15～20片。采后立即洗净擦干，然后将果肉切碎混匀，叶片去除主叶脉和1 cm叶缘后剪碎混匀，液氮中迅速冷冻，贮藏于-80 ℃超低温冰箱，用于抗氧化酶系统（SOD、POD、CAT、APX和GR）活性测定。

1.3 试验方法

SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定，560 nm波长测定其OD值，以抑制NBT光化学还原50%为1个酶活性单位[7]。POD活性采用愈创木酚染色法测定，以愈创木酚为底物，470 nm波长测定其OD值，以每分钟OD470变化（升高）0.01为1个酶活性单位[8]。CAT活性采用紫外吸收法测定，240 nm波长测定其OD值，以每分钟OD240减少0.1为1个酶活性单位[9]。APX活性采用紫外吸收法测定，290 nm波长测定其OD值，根据每分钟OD290值变化0.01定义为一个酶活性单位[10]。GR活性采用紫外吸收法测定，340 nm波长测定其OD值，以每分钟OD340值变化0.01定义为1个酶活性单位[11]。SOD、POD、CAT、APX和GR活性采用南京建成生物工程研究所研制的酶活性测定试剂盒进行测定，测定的结果均以U/g表示。

1.4 数据分析

试验数据用Excel统计整理、SPSS 16.0软件进行统计分析，采用SigmaPlot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 脐橙生长发育期果实和叶片SOD活性分析

SOD是植物体内清除O2-的重要物质，对保护细胞免遭氧化伤害起重要作用。由图1可知，脐橙生长发育期果实和叶片SOD活性变化趋势相反，果实SOD平均活性比叶片低11.29%。果实SOD活性先降低后升高，9月降到活性谷值，降幅为31.59%；叶片SOD活性先升高，后降低，9月出现活性峰值，升幅为82.34%，显著高于其他月份；11月份，果实SOD活性高达349.51 U/g，高于叶片17.66%。产生以上结果与7—9月份赣南气温升高，脐橙叶片SOD酶消除细胞中产生的O2-作用增强，减轻了O2-引起的膜伤害，控制膜过氧化水平，从而保护叶片不受高温胁迫的伤害。整个生长发育期，果实和叶片SOD活性变化相反，表明SOD酶在脐橙不同组织和不同发育时期起着不同的作用，果实和叶片清除活性氧的机制存在差异。

图1 脐橙果实和叶片SOD活性变化Fig. 1 Change of SOD activity in fruits and leaves of navel orange

2.2 脐橙生长发育期果实和叶片POD活性分析

脐橙生长发育期果实和叶片POD活性均表现为“升高—降低”的趋势（图2），不同时期POD活性差异性显著。果实POD活性不仅始终低于叶片，而且果实POD活性峰值出现的时间早于叶片30 d。9月份果实POD活性出现峰值126.45 U/g，增幅为33.09%；10月份叶片POD活性出现峰值161.49 U/g，增幅为45.80%。POD也是植物体内重要的O2-清除酶，与SOD协同清除植物体内产生的O2-，且POD是在SOD之后发挥对自由基的清除作用[12]。因此，脐橙生长发育期，果实和叶片POD总活性小于SOD活性，果实POD活性变化趋势不仅与SOD活性相反，而且活性峰值比叶片提前了30 d，表明POD酶是清除果实体内O2-的主要抗氧化酶。

图1 脐橙果实和叶片POD活性变化Fig. 2 Change of POD activity in fruits and leaves of navel orange

2.3 脐橙生长发育期果实和叶片CAT活性分析

CAT是存在于细胞的过氧化体中以H2O2为底物的酶，将细胞内过多的H2O2催化为O2和H2O，避免细胞受到H2O2毒害，以此发挥其抗氧化作用。脐橙生长发育期果实和叶片CAT活性是“先升高，后降低”（图3），与POD活性变化趋势一致。叶片CAT活性始终高于果实，其平均活性高于果实39.81%。9月份，果实和叶片CAT活性同时达到峰值125.46 U/g和193.47 U/g，增幅分别为48.72%和83.75%；9—11月，果实CAT活性下降缓慢，降幅为26.30%，叶片CAT活性迅速下降，降幅为41.28%。这与细胞承受的逆境能力有关，7—9月赣南气温上升，脐橙果实和叶片体内H2O2积累量增加，CAT活性被活化，进而加速了体内H2O2的分解，降低了O2-的积累，提高抗氧化能力，缓解高温胁迫。

图3 脐橙果实和叶片CAT活性变化Fig. 3 Change of CAT activity in fruits and leaves of navel orange

2.4 脐橙生长发育期果实和叶片APX活性分析

APX主要存在于植物叶绿体和细胞质中，是叶绿体中清除H2O2的关键酶，其活性升高，O2-产生速率下降，脂质过氧化作用减弱[13-14]。由图4可知，叶片APX活性始终高于果实，其平均活性高于果实42.29%。7—9月，果实和叶片CAT活性逐渐升高，9月份同时达到峰值60.18 U/g和88.79 U/g，分别增加了134.35%和109.16%；9—11月，果实和叶片APX活性逐渐降低，分别降低了62.81%和55.54%。对比结果发现，生长发育期果实和叶片APX活性变化趋势与CAT活性相同，但是果实和叶片APX活性极显著高于CAT活性，分别是其活性的2.58倍和2.54倍。因此，APX在脐橙植物体抗氧化中发挥着重要作用，这与其参与叶绿体和细胞质的H2O2代谢有关。

图4 脐橙果实和叶片APX活性变化Fig. 4 Change of APX activity in fruits and leaves of navel orange

2.5 脐橙生长发育期果实和叶片GR活性分析

GR是一种利用还原型NADP将氧化型谷胱甘肽（GSSG）催化成还原型谷胱甘肽（GSH）的酶，为H2O2的清除提供还原力[15]。生长发育期果实GR活性从7月的6.62 U/g逐渐升高，10月达到峰值24.97 U/g，增幅为277.03%，10—11月逐渐降低了41.21%；叶片GR活性从7月份的10.86 U/g FW逐渐升高，9月达到峰值28.54 U/g，增幅为162.88%，9—11月逐渐降低了39.59%。GR活性的变化与POD活性存在一定的差异性，POD活性果实峰值早于叶片30 d，而GR活性果实峰值晚于叶片30 d。该研究结果与2种酶在参与植物抗氧化过程中所起的作用有关。

图5 脐橙果实和叶片GR活性变化Fig. 5 Change of GR activity in fruits and leaves of navel orange

3 结论与讨论

植物经过长期的进化形成了抵御逆境胁迫的抗氧化系统，维持植物体内ROS代谢的动态平衡，这是植物抵御逆境胁迫伤害的重要机制[16]。SOD是ROS清除机制中第1个发挥作用的抗氧化酶[17]，被称为保护机制的中心[18]。POD是广泛存在于植物体内的氧化还原酶，以H2O2作为氧化剂生成H2O。CAT则是以专一性底物H2O2反应生成H2O和O2的氧化酶，主要存在于叶绿体和细胞的过氧化物内[19]。SOD能使超氧化物发生歧化反应生成O2和H2O2，生成的O2和H2O2再经POD和CAT催化生成水，由此降低或解除了O2-对细胞内物质的直接伤害[20-21]。APX是一类参与植物细胞AsA-GSH循环的重要酶类[22]，以抗坏血酸为电子供体，快速催化细胞中产生的过量H2O2分解生成H2O和O2，保护叶绿体和其他细胞组分免受活性氧毒害，从而提高植物对氧化胁迫的耐受性[23]。而GR又是一种利用还原型NADP将氧化型谷胱甘肽（GSSG）催化成还原型谷胱甘肽（GSH）的酶，可提高GSH含量，为ROS的清除提供还原力[15]。

本研究通过分析脐橙生长发育过程中SOD、POD、CAT、APX和GR活性变化可知，不同发育时期，果实和叶片5种抗氧化酶活性差异性显著，不同抗氧化酶之间存在着协作机制，其中SOD活性最大，CAT和POD次之，APX和GR活性最小。叶片5种抗氧化酶活性均高于果实，叶片抗氧化酶活性均呈现“升高—降低”的趋势，表明发育期末，叶片抗氧化酶活性的降低将导致内部氧化—抗氧化平衡的打破和叶片的衰老加速，这与华安明等[24]的研究结果一致。同时，随着7—9月份赣南气温逐渐升高，果实4种抗氧化酶（CAT、POD、APX、GR）和叶片5种抗氧化酶活性都是逐渐升高，表明高活性的SOD酶会导致植物体内H2O2的大量积累，为降低过氧化物对植物细胞功能的损坏，需要依赖CAT和POD 2种酶的共同作用来催化H2O2生成水，以达到清除高温胁迫下脐橙植物体积累的ROS目的，因此SOD、CAT和POD共同组成脐橙植物体关键的保护酶系统。APX和GR酶则协助脐橙关键酶系统清除体内积累的过量ROS。可见，SOD、POD、CAT、APX和GR在脐橙植物体ROS的清除中相互调节，共同参与调控ROS代谢和细胞脂过氧化程度，是脐橙植物体抗高温胁迫的一种响应机制，为赣南脐橙的抗高温栽培和品种选育提供了参考。