应用SE-μPADs法检测库尔勒市动物源食品中沙门菌的效果评价

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(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.新疆库尔勒市畜牧兽医站,新疆库尔勒市 841000)

沙门菌是一种能严重威胁到人类健康的食源性致病菌之一,人如果食用了被一定浓度沙门菌污染的食物会引起中毒,导致伤寒、肠热症、败血症、胃肠炎等疾病[1]。根据美国疾病控中心的统计数据显示[2-3],每年在美国由沙门菌引发的食源性疾病常常居于食源性疾病的前列,从2006年到2017年,沙门菌占所有食源性疾病爆发的53.4%,自2008年以来,欧洲确诊感染沙门菌病病例呈逐渐下降的趋势,但肠炎沙门菌感染的比例在不断增加。在中国,每年由沙门菌造成的食物中毒事件层出不穷,因此建立有效、快速的检验方法对于预防和控制沙门菌病十分重要。

目前,沙门菌的检测方法较多,比较传统的是国家标准方法检测沙门菌,其中分子生物学、免疫学等方法的发展大大提高了沙门菌检测灵敏度,缩短了检测时间,简化了检测程序[4],但对操作人员以及环境要求较高,血清易产生交叉反应而造成假阳性或假阴性,在检测时间上不能适应疫情发生时的快速检测。近年来,随着畜禽产业的发展及动物性食品的增多,沙门菌的快速检测也随之重要起来。微流纸基分析装置(microfluidic paper-based analytical devices,μPADs)技术利用酶-底物法来减少操作步骤,缩短检测时间。前期研究得到E.coli+S.en-μPADs快速检测装置并申请专利[5]。沙门菌微流纸基分析装置(Salmonellamicrofluidic paper-based analytical devices SE-μPADs)能满足上述快速检测的要求,但效果还有待评价,本实验分别用SE-μPADs快速检测方法与国家标准方法对库尔勒市某市场及屠宰场中的不同动物源(鸡、牛、羊)的胴体拭子、肛拭子、操作工具、肉样进行沙门菌的检测,为SE-μPADs快速检测试纸的推广提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

营养琼脂(nutrient agar,NA)、营养肉汤(nutrient broth,NB)、蛋白胨缓冲液(buffered peptone water,BPW)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(xylose lysine desoxycholate,XLD)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(selenite cystine,SC)、亚硫酸铋培养基(bismuth sulfite,BS)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(tatrathionate broth,TTB) 青岛海博生物技术有限公司;沙门菌显色培养基 法国科玛嘉;TAE 北京鼎国昌盛有限公司;Taq MasterMix、DNA Marker Takara;标准肠炎沙门菌CVCC 3762菌株 中国兽医微生物菌种保藏管理中心;2-Naphthyl caprylate J&K Scientific bvba公司;无水乙醇 天津市致远化学试剂有限公司;SE-μPADs快速检测试纸(已申请专利[6]) 本实验室制备。

LDZX-50 KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2FD博迅净化工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;DHP-9162恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;BCD-219D冰箱 青岛海尔股份有限公司;PL203电子天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司;ST-98AB多功能振荡器 北京桑翌实验仪器研究所;DYCP-31 DN水平电泳槽、DYCP-31 DN稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂;GELDOCXR+凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司;Canon LIDE220扫描仪 佳能公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 在库尔勒市某市场及定点屠宰场采集样本共380份,其中牛羊肉各41份,牛胴体拭子54份、羊胴体拭子67份,操作工具10份,羊肛拭子15份,鸡肛拭子152份,采样方法参照GB 4789.1-2016食品安全国家标准食品微生物学检验总则[7]。

1.2.2 样品处理

1.2.2.1 国家标准方法样品处理 按照GB 4789.4-2016[7]进行处理。

1.2.2.2 SE-μPADs快速检测方法的样品处理 肉样的处理:无菌称取5 g新鲜肉样并剪碎,置于盛有45 mL营养肉汤的锥形瓶中,顺时针摇匀,时间为1～2 min,取1 mL的样品处理液加入9 mL的BPW中,进行密封并放入37 ℃恒温培养箱内,培养15 h。胴体及操作工具拭子的处理:将采集胴体及操作工具后的拭子进行前增菌处理,取1 mL的样品处理液加入9 mL的BPW中置于37 ℃恒温摇床上,以160～180 r/min的转速培养15 h。

1.2.3 国家标准方法检测沙门菌 将处理好的样品分别加入SC与TTB增菌液,并置于37 ℃恒温摇床上培养18～24 h,再分别接种至XLD、BS琼脂选择性培养基上分别培养24、48 h。将疑似菌株接至沙门菌显色培养基并用水煮法[8]提取菌落DNA,对invA基因和16S rRNA基因进行PCR鉴定,引物序列表如表1所示,并将阳性产物送测序,测序结果在NCBI数据库与BLAST中的结果比对。invA基因PCR的反应参数为94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min,35个循环。25 μL的反应体系包括10 μL Mix;上下游引物各0.5 μL,模板1 μL,dd·H2O 13 μL。PCR反应体系中阴性对照的模板为1 μL的dd·H2O外;阳性对照的模板为沙门菌标准菌株的DNA。

表1 沙门菌引物序列和扩增长度Table 1 Salmonella primer sequences and amplification length

1.2.4 SE-μPADs检测方法 将处理好的样品取1 mL加入盛有5 mL BPW的离心管中,置于37 ℃恒温摇床上,以180～200 r/min的转速培养5 h。将富集5 h的菌液滴加至SE-μPADs的点样区(SE-μPADs为三联试纸,纸片中央为点样区,左右两侧为加底物的显色区),再将SE-μPADs快速检测试纸放入37 ℃恒温培养箱,培养1.5 h。每组试验均设计空白对照,空白对照即为不加菌液的BPW。同时每组均设两个重复。滴加沙门菌底物的区域滴加固蓝B盐进行显色反应,反应完成后,观察SE-μPADs显色情况,若试纸左右两侧显色区域与阳性对照一致,显示紫色,则可判断为疑似阳性,若显色区域的颜色未出现紫色(与空白对照组一致为淡粉色)则可初步判定为阴性,并且对SE-μPADs区域用扫描仪进行扫描,用软件ImageJ 1.4u读取SE-μPADs快速检测试纸的灰度值。最终结果判定:若显色区域的灰度值大于空白对照组的灰度值,则代表检测结果为检出沙门菌;若显色区域的灰度值小于等于空白对照,则代表未检出沙门菌。SE-μPADs检测出的疑似沙门菌继续进行PCR验证invA基因与16S rRNA基因,同1.2.4。

表3 SE-μPADs检测结果Table 3 Detection results of SE-μPADs

1.2.5 SE-μPADs阳性符合率(灵敏度)、阴性符合率(特异性)的计算 计算两种方法的阳性符合率、检测方法的阳性符合率(灵敏度)及阴性符合率(特异性)是按照卫生统计学[9-10]公式进行计算(表2)。

表2 两种检测方法比较Table 2 Comparison of two detection methods

1.3 数据处理

实验数据用Office 2010 EXCLE软件进行汇总与处理。

2 结果与分析

2.1 国家标准方法检测结果

应用国家标准方法GB 4789.4-2016,对380份样品进行选择性增菌,然后接至XLD与BS两种选择培养基上,选择带有典型菌落的共76株菌,接至显色培养基进行验证,如图1,出现紫色菌落的样品有15株。挑取紫色菌株进行PCR验证(图2),有6株为沙门菌,在羊肉中检出2株,分别在羊胴体、牛胴体、鸡肛拭子、操作工具中各检出1株。

图1 沙门菌在显色培养基上的形态Fig.1 Morphology of Salmonella on chromogenic

图2 沙门菌invA的PCR检测结果Fig.2 Detection of Salmonella invA by PCR注:1:DL2000 DNA Marker;2:阳性对照;3:阴性对照;4～5:肉样;6:鸡肛拭子;7:羊胴体拭子;8:牛胴体拭子;9:操作工具拭子。

2.2 SE-μPADs快速检测方法检测结果

由表3可知,经SE-μPADs法检测380份样品后,有25株菌颜色灰度值大于空白对照组的颜色灰度值(图3),对25株菌按照国家标准方法进行验证,接种于显色培养基上并进行PCR鉴定(图4),结果检测出10株沙门菌,其中肉样3株、牛胴体拭子3株、羊胴体拭子1株、操作工具1株、鸡肛拭子2株,阳性率为2.63%。

图3 部分SE-μPADs快速检测结果Fig.3 Rapid detection results of partial SE-μPADs 注:纸片中间为点样区,左右两侧圆形为显色区;1:阳性对照;2:空白对照;3:鸡肛拭子;4:胴体拭子。

图4 SE-μPADs筛出的沙门菌PCR检测结果Fig.4 Detection of Salmonella invA by PCR of SE-μPADs screening注:1:DL2000 DNA Marker;2:阳性对照;3:阴性对照;4～7:样品。

2.3 SE-μPADs快速检测法检测效果评价

分别根据SE-μPADs检测方法和国家标准方法的检测结果,SE-μPADs方法的初筛率为6.58%(25/380),而国家标准方法初筛率为20%(76/380),SE-μPADs方法较国家标准方法初筛率低。SE-μPADs检测方法与国家标准方法具体检测结果见表4,根据卫生统计学计算表格中SE-μPADs的阴性符合率(特异性)94.92%、阳性符合率(灵敏度)为100%。

表4 SE-μPADs和国家标准方法的比较Table 4 Comparison of the SE-μPADs and the national standard methods

2.4 库尔勒市沙门菌的污染情况

同时应用两种方法对380份样本进行检测,结果显示,SE-μPADs检测方法和国家标准方法检测出沙门菌10株,由表3可以看出,总检出率为2.63%,其中肉样82份,检出3份,检出率为3.66%;胴体拭子共121份，检出4份，胴体拭子检出率为3.31%(牛胴体拭子54份,检出3份,检出率为5.56%;羊胴体拭子67份,检出1份,检出率为1.49%);操作工具10份,检出1份,检出率为10.00%,鸡肛拭子共152份,检出2份,检出率为1.31%。

3 结论与讨论

3.1 库尔勒市沙门菌的污染情况

本次对库尔勒市市场及屠宰场内的牛羊肉及其胴体表面、加工用具,鸡、羊肛拭子中的沙门菌污染情况调查研究显示:加工用具、牛羊肉及其胴体表面、鸡肛拭子中均存在沙门菌污染的情况,使用两种方法共检测380份受检样品,共同筛出沙门菌阳性样品数为10份,沙门菌的阳性检出率为2.63%,可见库尔勒市屠宰场中肉样和胴体拭子表面均存在沙门菌的污染。

本次对库尔勒市场和屠宰场中的肉的污染率为3.66%,其胴体拭子3.31%。有研究表明,肉类及肉制品最易受到沙门菌的污染,Niyonzima等[11]检测了肉类及其制品,显示肉中的沙门菌污染率达到了21.4%。由于沙门菌在环境中广泛存在,养殖场及其周围可通过被污染的土壤及水源传播,抵抗力较低的畜禽最易受感染,而这些畜禽是市场中肉制品的主要来源,若没有及时控制污染源,极易造成污染扩散,污染的刀具等加工用具造成健康畜禽肉的二次污染[12]。这提示有关部门应加强对肉制品的监管,防止肉制品中沙门菌引起的食物中毒的爆发。

3.2 SE-μPADs快速检测方法与国家标准方法结果对比

目前关于纸基微流控制芯片技术检测沙门菌的相关报道较少,Jokerst等[13]利用酶底物法检测沙门菌,从增菌到检出时间仅需8～12 h,在富集期仅3 h后检测到鼠伤寒沙门菌,检测到的酯酶量为0.52±0.06 μg/mL。Bisha等[14]用μPAD检测农业用水中的沙门菌,从制作装置到显色需要24 h。从两种方法对沙门菌的检测时间分析,国家标准方法检测沙门菌从初增菌到接种至选择性培养基上出现典型菌落需要约3 d,而SE-μPADs快速检测试纸完成初筛需要21.5 h,与国家标准方法比较,在初筛的过程中缩短了约2 d,缩短了沙门菌的检出时间。本实验中在两种方法的初筛过程中SE-μPADs快速检测方法从粗增菌到显色筛出疑似沙门菌的初筛率为6.6%,低于国家标准方法的初筛率20%(从初增菌到选择性培养基出现典型菌落),进一步对该方法进行验证,PCR方法进行鉴定后SE-μPADs快速检测方法与国家标准方法的阳性符合率(灵敏度)为100%,说明SE-μPADs快速检测方法能够完成样品的初筛工作,但在检测过程中SE-μPADs快速检测方法的阴性符合率(特异性)为94.92%,说明SE-μPADs快速检测试纸还存在假阳性的问题,这提示SE-μPADs快速检测试纸还有待进一步优化,减少假阳性,提高检测的特异性。SE-μPADs快速检测法具有快速简单直观经济等优点,且试纸的成本更低,而且无需任何特殊荧光仪器设备,仅需肉眼可观测到颜色,结果更加直观。该检测装置利用比色的方法检测食品中的沙门菌,相对于标准的培养技术,富集时间显著减少,因此SE-μPADs快速检测法是一种简便、快捷的沙门菌检测方法。SE-μPADs检测装置未来发展的目标是通过尝试使用特异性诱导剂来增强酶的产生,以及利用选择性富集培养基抑制竞争性微生物的生长来提高检测限,缩短检测时间,减少假阳性率的发生。

4 结论

SE-μPADs快速检测方法能够完成样品的初筛,阳性符合率可以达到100%;库尔勒市屠宰场及市场均存在沙门菌的污染且肉样中沙门菌污染率较高,相关部门应加强屠宰场及市场中沙门菌的检测及监管。