淀粉诱导奶牛乳脂下降后奶牛瘤胃细菌菌群变化

徐晓锋，郭 成

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

随着奶牛养殖业向集约化、高效化发展，许多养殖场通过提高精饲料浓度来满足高产奶牛的能量需求，提高奶牛的生产性能。研究表明，在饲料中适当添加精制玉米淀粉，可以增加瘤胃中碳水化合物水平，提高泌乳中期奶牛的生产性能[1]。然而，在现代奶牛生产中，为了追求更高的经济效益，生产者往往会给奶牛饲喂过多的高精饲粮。由于高精饲料富含淀粉，且淀粉在瘤胃中能迅速地分解释放出大量的挥发性脂肪酸，使得瘤胃酸性迅速下降。当奶牛饲料中谷物含量达到30%～40%时，瘤胃内易发酵碳水化合物急剧上升并迅速转化为葡萄糖，淀粉与葡萄糖降解释放出大量的挥发酸，使瘤胃酸度迅速下降[2]。在奶牛生产中给奶牛饲喂谷物含量较高的饲料后，瘤胃内谷物迅速发酵，产生一系列异常的、有毒的、致炎性的代谢物，直接对奶牛的健康造成威胁或潜在威胁[3]。

饲喂高精饲料会对奶牛瘤胃菌群产生影响。Dehority等[4]研究表明，当饲喂高纤维饲料时，瘤胃纤维降解菌的浓度显著增加。杨宏波等[5]研究不同精粗比饲料对断奶公犊牛瘤胃微生物的影响，发现高精饲料阻碍了奶牛瘤胃纤维降解菌的生长。Belanche等[6]对比了粗饲料和高精饲料饲喂的羔羊，发现饲喂粗饲料的羔羊瘤胃中有更多的产琥珀酸丝状杆菌，厌氧真菌和细菌菌群的多样性也更多。随着日粮中精饲料比例的增加，瘤胃纤维降解菌的生长会受到抑制[7]。过高比例的精饲料还会导致牛奶中脂肪酸组成发生改变，导致乳脂率下降。曹洋等[8]研究表明，高精饲料导致奶牛肝脏脂肪酸合成代谢减弱而分解代谢增强，肝脏内乳脂前体物发生重分配，乳脂前体物输出减少，影响了乳脂合成。乳脂率易受营养因素影响，乳脂降低综合征[9]的奶牛日粮大多都有纤维素含量低、瘤胃易发酵碳水化合物含量高的特点[10]。本试验以泌乳期奶牛为研究对象，使用玉米淀粉诱导奶牛乳脂降低，研究其对奶牛瘤胃菌群的影响，为高精饲料导致的奶牛乳脂下降的日粮瘤胃发酵调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米淀粉由宁夏农垦贺兰山奶业公司提供。

1.2 试验动物与饲粮

试验于宁夏回族自治区银川市西夏区宁夏某奶牛场进行。选取同一个圈舍体况良好、体质量相近、胎次相同、产奶量接近的泌乳期中国荷斯坦奶牛4头作为试验动物。根据NRC(2001)奶牛饲养标准配制基础日粮，基础日粮组成和营养成分见表1。试验动物采用全混合日粮(TMR)饲喂方式，日投料3次，自由采食，全天自由饮水。

表1 基础日粮组成及营养水平(干物质基础)

Table1Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

项目Items含量Content原料Ingredients 豆粕Soybeanmeal11.30 菜籽粕Rapeseedmeal3.20 全棉籽Wholecottonseed3.50 麸皮Wheatbran3.18 压片Tabletcorn11.06 甜菜颗粒Beetgranule2.49 啤酒糟Brewer sgrains3.16 苜蓿青贮Alfalfasilage4.12 苜蓿Alfalfa10.32 玉米青贮Cornsilage45.06 碳酸氢钙Dicalciumphosphate0.62 石粉Limestone0.39 小苏打Bakingsoda0.30 氧化镁Magnesiumoxide0.50 食盐Salt0.30 脱霉素Demycin0.10 预混料Premix0.40合计Total100.00营养水平Nutritionlevels 粗蛋白CP17.14 钙Ca0.76 磷P0.46 中性洗涤纤维NDF35.78 淀粉Corn24.25 产奶净能NE1)L/(MJ·kg-1)6.00

1)产奶净能为计算值，其他为实测值。

1)NELwas a calculated value， while the others were measured values.

1.3 试验设计

参考朱河水等[11]方法，采用自身对照试验设计。试验开始前以基础日粮饲喂奶牛，预饲3 d，以减少奶牛应激；之后继续以基础日粮饲喂并作为对照(CK)，饲喂7 d；试验期每头奶牛日粮中添加1.5 kg·d-1玉米淀粉，饲喂15 d，作为试验组(C)。添加玉米淀粉时，参考Weimer等[12]方法，使饲粮中淀粉营养水平达到27%。玉米淀粉每日添加2次，每次添加750 g，以灌服方式添加，保证奶牛每日添加的淀粉完全采食。

1.4 样品采集与处理

1.4.1 瘤胃液采集

使用负压吸取装置(自行设计)，通过奶牛口腔釆集瘤胃液。采集的时间分别为饲喂前(0 h)及饲喂后2、4、6 h，每次取样50 mL。为获得具有代表性的样品，每天4个时间点所取的瘤胃内容物样品经混匀后各取5 mL，充分混合，转入冻存管置液氮临时保存，转移到试验室-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 牛奶采集

试验牛每日清晨固定时间采奶，每次挤奶取2个奶样，各50 mL，奶样来自4个乳区，混合后直接测定牛奶成分。

1.4.3 瘤胃液DNA提取

取2 mL瘤胃液，采用试剂盒法提取瘤胃微生物DNA，试剂盒采购于南京建成生物研究所。每头牛每个时间段瘤胃液取3管样品，即3个重复。

1.4.4 PCR扩增

PCR扩增前用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度和浓度，于离心管中取适量的样品进行稀释。将稀释后的基因组DNA作为模板。瘤胃液DNA扩增目的片段为V3+V4区，引物序列为341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′[13]。

1.4.5 PCR产物的混样与纯化

PCR产物使用胶浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；依照PCR产物浓度的检测结果进行等浓度混样，充分混匀后使用胶浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用南京建成生物研究所提供的回收试剂盒回收产物。

1.4.6 Hiseq测序

将样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行Hiseq测序，采用Hiseq 2500 PE 250平台，数据由平均值和标准误表示，以P<0.05作为差异显著性判定标准。

2 结果与分析

2.1 添加淀粉对牛奶成分的影响

由表2可见，在添加淀粉后，牛奶中乳脂率极显著降低(P<0.01)，但是乳蛋白率和乳糖率没有显著影响。

2.2 奶牛瘤胃细菌菌群结构分析

2.2.1 瘤胃细菌菌群OTUs比较

经Illumina Hiseq测序结束后，除去低质量序列，通过序列拼接，应用Mothur根据97%的序列相似度，对序列进行OTU聚类，对样品进行OTU的统计，剔除稀有OTU后对照组样品获得2 900个，试验组样品获得2 931个，样品间差异不显著(P>0.05)，2个样品共享OTU为2 472个(图1)。

2.2.2 瘤胃细菌alpha多样性分析

基于OTU结果，计算样品的alpha多样性，如表3所示。饲喂玉米淀粉奶牛瘤胃细菌菌群的Chao1值、Ace值、Shannon指数和Simpson指数与对照组均无显著差异(P>0.05)，说明饲喂玉米淀粉对瘤胃细菌多样性和种类分布均匀度均无显著影响。本试验的瘤胃液样品的Shannon曲线见图2(每个样本3个重复)。如图所示，当测序深度超过12 500 reads时，曲线趋于平缓，各样品达到饱和状态，表明本试验的测序深度足以覆盖各样品中大多数微生物。

表2 添加淀粉对牛奶成分的影响

Table2Effect of adding starch on milk fat of dairy cow %

项目Item对照组Controlgroup(CK)试验组Experimentalgroup(C)乳脂率Fatrate/%4.05A2.40B乳蛋白率Proteinrate/%3.25a3.35a乳糖率Lactose/%4.95a5.05a

同行数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

In the same row， values with different small letters showed significant difference (P<0.05)， and with different capital letters showed extremely significant difference (P<0.01).

图1 玉米淀粉对瘤胃细菌菌群基因OTU分布的影响

2.2.3 奶牛瘤胃细菌在门水平上的结构变化

表4为玉米淀粉对瘤胃菌群的影响，只列出部分结构变化较大或者占总菌群比例较多的菌门，共涉及28个门。由表可知，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)占总菌群比例的90%。与对照组相比，玉米淀粉导致瘤胃芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、软壁菌门(Tenericutes)丰度极显著降低(P<0.01)，装甲菌门(Armatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)丰度显著降低(P<0.05)，厚壁菌门(Firmicutes)丰度显著增加(P<0.05)；放线菌门(Actinobacteria)丰度有增加趋势(P<0.1)。

表3 样品在0.03距离下的Alpha丰富程度表

Table3Alpha richness table of samples at the distance of 0.03

项目ItemLabelChao1值Chao1valueAce值AcevalueShannon指数ShannonindexSimpson指数Simpsonindex覆盖率Coverage/%对照组Controlgroup(CK)0.033866.473780.217.960.9899.29试验组Experimentalgroup(C)0.033894.403810.998.390.9799.29P-value—0.930.810.130.25—

图2 玉米淀粉对瘤胃细菌菌群基因Shannon指数的影响

2.2.4 奶牛瘤胃细菌在属水平上的结构变化

本试验中，奶牛瘤胃液菌群总共涉及383个菌属，其中90个菌属差异显著(P<0.05)，表5只列出部分结构变化较大或者占总菌群比例较多的菌属。由表可知，瘤胃菌科UCG-014菌属(Ruminococcaceae UCG-014)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、瘤胃球菌属-2(Ruminococcus-2)、克里斯滕森菌科R-7菌属(Christensenellaceae R-7)、魏斯氏菌属(Weissella)、普雷沃氏菌属-1(Prevotella-1)丰度较高，其中Ruminococcaceae UCG-014丰度极显著增加(P<0.01)，魏斯氏菌属(Weissella)丰度显著增加(P<0.05)；肠球菌属(Enterococcus)丰度极显著降低(P<0.01)，葡萄球菌属(Staphylococcus)丰度显著降低(P<0.05)，其他优势菌属变化不显著。其他菌属如醋酸杆菌属(Acetobacter)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、小球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、毛螺旋菌属-1(Lachnoclostridium-1)、瘤胃球菌属-1(Ruminococcus-1)、普雷沃氏菌属-7(Prevotella-7)、假丁酸弧菌属(Pseudoscardovia)、罗斯氏菌属(Roseburia)等丰度极显著增加(P<0.01)，乳酸乳球菌(Lactococcus)等丰度显著增加(P<0.05)，厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、肠球菌属(Enterococcus)、栖水菌属(Enhydrobacter)等丰度极显著降低(P<0.01)，芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)等丰度显著降低(P<0.05)。

表4 添加玉米淀粉在门水平上对奶牛瘤胃菌群丰度的影响

Table4Effect of adding starch on rumen flora structure at phylum level

门Phylum对照组Controlgroup(CK)/%试验组Experimentalgroup(C)/%P-value芽单胞菌门Gemmatimonadetes0.0007±0.000600.0019软壁菌门Tenericutes0.6040±0.10130.2933±0.01950.0040装甲菌门Armatimonadetes0.0035±0.00060.0017±0.00040.0190厚壁菌门Firmicutes35.5208±2.924243.8389±1.76850.0170酸杆菌门Acidobacteria0.0006±0.00030.0001±0.00010.0385蓝藻门Cyanobacteria0.3855±0.06310.2342±0.04080.0500放线菌门Actinobacteria0.4421±0.07520.8671±0.21210.0609未注释菌门Bacteria-NA0.0649±0.00820.0497±0.00300.1179广古菌门Euryarchaeota0.1763±0.03700.1058±0.02110.1039变形菌门Proteobacteria7.5804±4.04050.9094±0.11120.1329迷踪菌门Elusimicrobia0.0117±0.00290.0092±0.00220.5225疣微菌门Verrucomicrobia0.8648±0.11710.7388±0.12850.4695拟杆菌门Bacteroidetes51.9058±5.561150.6371±1.84050.8432

表5 添加玉米淀粉在属水平上对奶牛瘤胃菌群丰度的影响

Table5Effect of adding starch on rumen flora structure at genus level

属Genus对照组Controlgroup(CK)/%试验组Experimentalgroup(C)/%P-value醋酸杆菌属Acetobacter0.0014±0.00040.0275±0.00540.0010氨基酸球菌Acidaminococcus00.0046±0.00170.0010厌氧弧菌属Anaerovibrio0.0500±0.00620.0238±0.00360.0010肠球菌属Enterococcus4.8775±1.40990.1867±0.03470.0010毛螺旋菌-1Lachnoclostridium-10.0191±0.00310.1076±0.01620.0010乳酸杆菌属Lactobacillus0.3810±0.08862.3674±0.37750.0010小球菌属Pediococcus0.0210±0.00440.0993±0.02720.0010瘤胃菌科UCG-014菌属RuminococcaceaeUCG-0141.0878±0.16992.2126±0.29400.0010瘤胃球菌属-1Ruminococcus-10.1215±0.00780.2772±0.03850.0010栖水菌属Enhydrobacter0.0300±0.01430.0004±0.00010.0020明串珠菌属Leuconostoc0.0059±0.00110.1002±0.03520.0020普雷沃氏菌属-7Prevotella-70.0752±0.00352.1454±1.08120.0020罗斯氏菌属Roseburia0.0299±0.00370.2967±0.13010.0020月形单胞菌属-4Selenomonas-40.0057±0.00120.0017±0.00030.0020假丁酸弧菌属Pseudoscardovia0.0001±0.00010.0109±0.00350.0060琥珀酸弧菌属UCG-001SuccinivibrionaceaeUCG-0010.0150±0.00350.0609±0.01620.0060葡萄球菌属Staphylococcus0.0049±0.00250.0003±0.00010.0100魏斯氏菌属Weissella1.9142±0.85167.5733±2.22350.0260未注释韦荣球菌属Veillonellaceae-NA0.0010±0.00030.0065±0.00250.0280乳酸乳球菌Lactococcus0.2395±0.08031.2408±0.43650.0340泛菌属Pantoea0.0499±0.02980.0017±0.00060.0340月形单胞菌属-1Selenomonas-10.0627±0.02350.0087±0.00140.0340巨球菌属Megasphaera0.0001±0.00010.0005±0.00030.0391普雷沃氏菌属-1Prevotella-136.5587±4.956728.2502±2.28740.1399未注释菌属NA2.7809±0.21972.4004±0.18740.2198链球菌属Streptococcus2.0133±0.37271.5345±0.29430.3337ChristensenellaceaeR-74.3536±0.60483.4828±0.18390.1898瘤胃球菌属-2Ruminococcus-23.4513±0.57064.3394±0.81560.3736芽孢杆菌属Bacillus0.1065±0.06690.0038±0.00070.0220

3 讨论

本试验奶牛瘤胃细菌菌群测序深度超过12 500 reads后，曲线均趋于平缓，各样品达到饱和状态，覆盖率超过99%，测序深度和覆盖率超过了郭婷婷等[14]和杜琪等[15]，测序结果基本可以反映出奶牛瘤胃细菌区系中的大部分物种。

本试验中，乳脂在玉米淀粉诱导后期极显著降低。薛丰[16]研究表明，随着日粮粗饲料品质提高，细菌、原虫及纤维降解菌的数量呈上升趋势。郭鹏等[17]研究表明，当日粮NFC/NDF值由1.02升至1.24(日粮精粗比由50%上升至60%)时，瘤胃细菌总数并未出现明显的改变；当NFC/NDF值为1.63(精粗比为70%)时，瘤胃细菌总数开始出现显著增加。本试验中，饲喂玉米淀粉对瘤胃细菌多样性和种类分布均匀度均无显著影响。

在门水平，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为奶牛瘤胃优势菌群，与Sadet-Bourgeteau等[18]和周熊艳等[19]的研究一致。在属水平，普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、魏斯氏菌属等是奶牛瘤胃的优势菌群，其中普雷沃氏菌属为瘤胃最优势菌属，与李子健等[20]和高雨飞等[21]的研究结果一致。

反刍动物瘤胃中的微生物将饲料发酵并转化为营养成分和能源物质供机体吸收利用。由细菌、真菌、原虫、古细菌等组成的瘤胃微生物群体成为宿主反刍动物必不可少的共生关系的复杂网络[22]。奶牛瘤胃中广泛存在着降解和利用淀粉的普雷沃氏菌属[23]，在本试验中，虽然普雷沃氏菌属-1在诱导乳脂下降后变化不显著，但是其家族其他菌属的变化有显著差异；产酸菌丰度大量增加，醋酸杆菌属、乳酸杆菌属、小球菌属、明串珠菌属、毛螺旋菌属-1、瘤胃球菌属-1、假丁酸弧菌属、罗斯氏菌属等丰度极显著增加；乳酸乳球菌等丰度显著增加。其中，魏斯氏菌属[24]、乳酸杆菌属、乳酸乳球菌、小球菌属[25]、明串珠菌属[26]的发酵产物主要是乳酸，醋酸杆菌属主要发酵产物为乙酸，雷沃氏菌属发酵产物主要为乙酸、琥珀酸和丙酸[27]，罗斯氏菌属、假丁酸弧菌属发酵产物主要为丁酸，瘤胃球菌属发酵产物主要是乙酸和甲酸，毛螺旋菌属发酵产物包括甲酸、乳酸、乙酸等。随着日粮精粗比提高，乳酸杆菌、反刍兽新月单胞菌、埃氏巨型球菌和淀粉分解菌的数量会出现不同程度的增加[28-29]，本试验结果与前人研究相似。韦荣球菌以乳酸利用为主[14]，本试验中，未注释韦荣球菌属丰度显著增加，这可能是由于产乳酸菌的增加，使其底物增加，从而增加其丰度。本试验中，厌氧弧菌属、肠球菌属、栖水菌属、厌氧支原体属等丰度极显著降低，芽孢杆菌属、泛菌属等丰度显著降低，这些菌属大多都是降解葡萄糖，属于产酸菌，其丰度降低的原因可能是由于这些菌群在瘤胃不是优势菌群，在与优势菌群竞争底物时处于劣势地位，由于竞争性抑制作用，出现了丰度降低的情况。

在淀粉低乳脂日粮诱导的模式下，瘤胃微生物的结构发生改变，其中6个菌门发生显著变化。试验共检测到383个菌属，90个菌属差异显著，大部分丰度有显著变化的菌群都是产酸菌，玉米淀粉诱导了瘤胃微生物的结构变化，促进了大部分产酸菌群的增殖。但是由于菌群数量很多，部分在瘤胃占菌群总比例较少的菌群没有一一进行分析，细菌之间的协同作用及数据还有待进一步整理和发掘。