新型产琼胶酶海洋细菌Arthrobacter sp. ZXY772的分离鉴定及其应用

陈彦梅 聂语琪 谢燕纯 邓素奇 张扬 周钦茂 陈琼华

摘要    从广东省南澳岛采集龙须菜（Gracilaria lemaneiformis），分离出一株酶活性较高的琼胶酶产生菌，探究其应用价值，通过筛选培养基分离产琼胶酶的菌株，采用形态学和16S rRNA基因序列分析对菌株进行初步鉴定，构建系统发育树;采用DNS比色法对琼胶酶活性进行测定;初步探究菌株所产琼胶酶类型和酶解产物的抑菌效果。结果表明，经分离纯化得到一株产琼胶酶海洋细菌ZXY772，该菌株为革兰氏阳性球杆菌，属于节杆菌属（Arthrobacter sp.）;胞外酶只产β-琼胶酶;该菌株于28 ℃、转速为180 r/min液体发酵培养基中振荡培养时，其生长对数期为3～14 h，当菌株摇床发酵至27 h，其琼胶酶活力到达最高96.0 U/mL;菌株粗酶液的酶解产物对枯草芽孢杆菌的抑制效果最强，其抑菌圈直径大小到达14.45 mm。

关键词    琼胶酶;节杆菌属;鉴定;抑菌

中图分类号    Q936        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）17-0237-04                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    A agarase-producing strain was isolated and identified from Gracilaria lemaneiformis collected from Nan′ao Island，Guangdong Province to study its wide application values. The agarase-producing strains were isolated by different screening culture-mediums，and identified by morphology and the analyses of 16S rRNA sequence to construct a phylogenetic tree. The agarase activity was determined by DNS colorimetry. Agarase type produced by the strains and the bacteriostatic effect of enzymatic hydrolysate were investigated.The results showed that after isolation and purification，a strain of agarase-producing ZXY772 was obtained. The strain was Gram-positive，coccus，belonging to Arthrobacter sp.，producing extracellular β-agarase.The strain was cultured in a liquid fermentation medium under the condition of 180 r/min and 28 ℃，the logarithmic phase of the strain was 3-14 h and the agarase activity of ZXY772 reached 96.0 U/mL after fermenting for 27 h.The enzymatic hydrolysate of the crude enzyme solution had the most obvious bacteriostasis to Bacillus subtilis，and the diameter of the inhibition zone reached 14.45 mm.

Key words    agarase;Arthrobacter sp.;identification;bacteriostasis

瓊胶（agar）是一种海洋多糖，普遍存在于石花菜、龙须菜等多种藻类植物及部分寄生在软体动物的海洋细菌当中。目前，工业大量生产琼胶的首要来源是海藻。

我国海域具有丰富的海藻资源，其中数千种海藻中有一百多种被认为有经济价值。近年来，我国在海藻养殖方面取得了很大进展，但在开发利用方面还比较薄弱，存在很大的资源利用空间。利用海藻生产出来的琼脂，水解成琼胶低聚糖即琼胶寡糖，具有多种生理活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗血栓等[1]，在食品、化工、医药、美妆方面[2]有重大的利用价值。当前利用琼胶获取琼胶寡糖的方法主要有生物酶法和化学法。其中，化学法处理有较多不足和局限，如较难精确控制水解度，后期的分离纯化过程十分复杂，不容易操作，而且利用该法生成的琼胶寡糖生物活性很低并容易丧失;而生物酶法作用环境十分温和，降解过程易控制，产物专一且易于分离纯化，工艺环保高效[3]。因此，为解决海藻深加工及琼胶寡糖开发利用所面临的瓶颈问题，新型高产琼胶酶菌株的开发及应用基础研究势在必行，这也是本试验研究的意义所在。

琼胶酶主要通过藻类生物和海洋微生物获得，其中海洋微生物来源居多。因此，获得高产琼胶酶菌株是开发微生物琼胶酶的前提条件。迄今，人们对琼胶酶产生菌的探究已经逐渐深入，现已从海洋藻类、海洋软体动物及淤泥中分离得到多株琼胶酶产生菌，包括假单孢菌属（Pseudomonas sp.）[4]、假交替单胞菌属（Alteromonas sp.）[5]、弧菌属（Vibrio sp.）[6]、船蛆杆菌属（Teredinibacter sp.）[7]、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）[8-11]和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）[12]等，但是普遍存在的问题是这些菌株所产琼胶酶活性低，多数报道的菌株产琼胶酶活力在10 U以下、降解琼胶能力普遍较低，远未能达到工业化生产琼胶寡糖的需求[13]，严重阻碍了海藻的深加工及琼胶寡糖的开发利用[14]。迄今只有Sigma公司从大西洋假单胞菌中分离的β-琼胶酶应用于生产且价格十分昂贵，目前应用范围仅限于科研工作中[15]。因此，筛选出高产琼胶酶菌株，对攻克当前琼胶酶活力低、产量小的难关具备重要的指导意义和应用价值，是我国研究海藻多糖降解酶的首要方向。

因此，本研究选择富含琼胶的海洋龙须菜作为琼胶酶产生菌的分离对象，通过多种不同的筛选培养基，从海洋龙须菜中分离得到产琼胶酶菌株，对其进行形态学及16S rRNA基因序列分类鉴定、发酵产酶研究，初步探究其酶解产物的抑菌性，旨在获得新型高产琼胶酶菌株，为琼胶酶及琼胶寡糖的开发利用奠定一定基础。

1    材料与方法

1.1    试验材料

新鲜海洋龙须菜，于2016年8月采自广东省南澳海域。

X-半海水固体培养基：琼脂粉15 g，蛋白胨6 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，人工海水配制，pH值7.2。2216E培养基：琼脂粉15 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高铁0.01 g，人工海水配制，pH值7.5。改良后培养基：MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4 0.1 g，（NH4）2SO4 2 g，K2HPO4 7 g，KH2PO4 3 g，琼脂粉15 g，人工海水配制，pH值7.2。富集培养基：琼脂粉2 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，NaCl 20 g，pH值7.0[16]。种子培养基：琼脂粉2 g，牛肉膏5 g，酵母膏1.5 g，Ca2+ 0.2 g，人工海水配制，pH值7.5。发酵培养基：琼脂粉2 g，麦芽糖1 g，柠檬酸三铵5 g，酵母膏1.5 g，Mg2+ 0.5 g，Ca2+ 0.2 g，Fe2+ 0.02 g，人工海水配制，pH值7.5。牛肉膏蛋白胨固体培养基：琼脂粉15 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，pH值7.2。牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，pH值7.2。

1.2    主要试剂与仪器

α-pNPG和β-pNPG（麦克林Macklin生产），琼脂为进口分析纯，其他试剂均为国产分析纯（均购买自广东环凯微生物科技有限公司）。SW-CJ-2FD超净工作台（Airtech公司），SX-50高压蒸汽灭菌锅（Tomy公司），PB-10精密pH计（Sartorius公司），BS423S天平（Sartorius公司），ETC 811 PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司），7230G紫外-可见分光光度计（上海诺科）。

1.3    试验方法

1.3.1    琼胶酶菌株的筛选。将从南澳岛采集到的海洋龙须菜，采用均质法和振荡法制备样品，取悬液接入富集培养基进行富集培养，对其进行系列稀释，制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 一系列梯度稀释菌悬液。依次涂布3个平板，并将涂布后的平板置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养2～7 d，观察其菌落的生长状况和特征。挑取周围具有明显水解圈或凹陷的菌落，在X-半海水固体培养基平板上进行3次以上划线纯化培养，将分离到的菌株平板点接培养后进行卢戈氏碘液染色，观察菌落周围产生的水解透明圈大小情况以便进行下一步试验。

1.3.2    菌株的形态学观察及鉴定。将挑选获得的高产琼胶酶菌株，经平板划线后置于28 ℃恒温培养箱培养18～24 h，肉眼观察其菌落形态特征。菌株的革兰氏染色、芽孢染色试验等参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]。

1.3.3    菌株的16S rRNA基因序列扩增、比对及系统发育分析。挑取少许活化菌体利用煮沸法对其进行破壁处理，作为PCR模板DNA。PCR引物分别选取细菌鉴定扩增通用引物27F（5′-AGAGTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGCTAC CTTGTTACGACTT-3′）。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，交由上海生工生物工程股份有限公司进行16S rRNA基因序列分析测定，将分析结果通过美国国家生物信息中心NCBI（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov）在GenBank上进行BLAST序列分析比对，分析待检菌株与其他菌株的同源关系，挑選与待检菌株相似度较高的模式菌，采用软件Mega 7.0建立系统发育树。

1.3.4    琼胶酶活力的测定。

（1）标准曲线的绘制。精确量取0.100 g干燥至恒重的半乳糖于100 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解，并定容至100 mL作为标准半乳糖溶液（1 mg/mL），准确依次量取该溶液0、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000、1.200、1.400、1.600 mL分别置于9支25 mL具塞比色管中[18]。按表1数据加入适量溶液，经沸水浴处理5 min，冷却定容至25 mL，得到半乳糖标准浓度为0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048、0.056、0.064 mg/mL，震荡摇匀后于波长540 nm下测OD值，并绘制标准曲线。

（2）DNS法测定琼胶酶酶活。挑取活化后的菌株2～3环接入装有60 mL培养液的100 mL种子培养基中，于28 ℃摇床培养18 h后，按4%接种量转接到装有100 mL培养液的500 mL摇瓶发酵培养基中，于28 ℃ 180 r/min振荡培养30 h后，取适量发酵液于4 ℃、5 000 r/min冷冻离心10 min，缓慢倒取上清液，即得发酵粗酶液进行下一步研究。

采用DNS测定还原糖的方法测定琼胶酶酶活力[19]。具体步骤如下：取100 μL粗酶液加入1 mL以NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液配制而成的琼脂底物中，置于适宜温度条件下45 ℃水浴处理30 min后，加入1.5 mL已在相同温度条件下预热的DNS溶液中，煮沸5 min，经冷却后加入蒸馏水定容至25 mL，充分摇匀，于波长540 nm处测定吸光值;以灭活处理的粗酶液为对照，利用半乳糖为标准品制作标准曲线，根据半乳糖标准曲线确定酶降解底物所产生还原糖的量[16]。将琼胶酶的活力定义为：在上述反应处理条件下，1 mL酶液1 min产生1 μg还原糖作为1个酶活力单位（U/mL）[20]。

琼胶酶活力（U/mL）=半乳糖含量（mg）×1 000×粗酶液（mL）×稀释倍数/反应体系中酶液加入量（mL）×时间（min）[16]

1.3.5    菌株生长曲线及产酶曲线的测定。利用灭菌接种环取活化菌株2～3环于配制好的种子培养基中，于28 ℃下恒温培养18 h后，依照4%比例接种至改良发酵培养基中，于28 ℃、180 r/min下摇床培养，定期取样于波长600 nm处测量其稀释10倍后菌液的吸光值，计算菌株生物量，并测定该粗酶液的产酶活力和pH值，绘制该菌株的生长曲线及产酶曲线。

1.3.6    琼胶酶类型的鉴别。参照Temuujin U[21]，马芮萍[12]等的方法，对照组、试验组各取1 mL 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH值7.0）与400 μL 4 mg/mL pNPG（α-pNPG和β-pNPG）置于45 ℃环境恒温水浴预热5 min。在试验组中快速加入1 mL在相同温度条件下预热好的新鲜酶液，对照组则加入高温煮沸灭活的酶液作为对照，混匀后均置于45 ℃水浴加热1 h，再加入1 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应，快速测定在波长420 nm下的吸光度值。

1.3.7    酶解产物抑菌性的测定。将发酵的粗酶液加入0.3%琼胶底物中，于45 ℃条件下振荡水浴90 min，160 r/min。所得样品于5 000 r/min离心10 min后取上清液，经200目筛过滤器得到的无菌琼胶寡糖溶液于4 ℃贮存备用。将指示菌株大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种适量于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37 ℃摇床恒温培养16～18 h。取0.9%无菌生理盐水配制成菌悬液，用移液枪吸取100 μL稀释菌液进行平板涂布。待平板表面无液体时，用无菌镊子取滤纸片贴在平板相应区域，吸取100 μL琼胶寡糖溶液于滤纸片上[22];平板中间的滤纸片加等量50 μg/mL氨苄青霉素作对照。其中，分别将指示菌株设为1组，各组均有1个阳性对照和1个阴性对照。阳性对照为只涂布指示菌株溶液的平板，阴性对照为只涂布无菌0.9%生理盐水的平板。将上述平板置于37 ℃培养箱中恒温培养16～18 h后，及时观察其抑菌效果。

2    结果与分析

2.1    产琼胶酶菌株的分离筛选及形态学观察

2.1.1    产琼胶酶菌株的筛选。从采集到的海洋龙须菜样品中分离筛选得到18株产琼胶酶菌株，其中1株菌株编号为ZXY772。对ZXY772菌株进行卢戈氏碘液法染色后，菌落四周形成较明显的透明圈，透明圈直径约为11.21 mm，如图1所示。由此表明该菌株对琼胶具有较显著的降解能力[23]。

2.1.2    产琼胶酶菌株的形态学观察。菌株平板分区划线结果和单染色镜检结果如图2所示，菌株ZXY772在琼脂平板上有明显的凹陷，在平板上可形成圓形菌落，菌落直径约为1～2 mm，因培养时间不同呈淡黄色至黄色，菌落表面微隆起，湿润光滑，边缘整齐。该菌株为革兰氏阳性（G+）细菌，短杆形至近球形，有明显的杆、球周期变化，呈V形排列，无芽孢。

2.2    菌株的16S rRNA基因序列扩增、比对及系统发育分析

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，在约1 500 bp处得到1条清晰、通亮、单一的条带，符合预期长度。将PCR扩增产物送往上海生工生物工程有限公司进行基因测序，经拼接获得1022个碱基序列，将分析结果交到GenBank数据库上（登录号XY4GUF9D014）。将测序所得基因序列在NCBI上通过BLAST与GenBank数据库的序列进行比对，菌株ZXY772的16S rRNA基因序列与Arthrobacter nicotianae strain BS23、Arthrobacter nicotianae strain S2、Arthr-obacter nicotianae strain YNA111等节杆菌属细菌的序列相似度达到99%，因而可初步判定ZXY772为节杆菌属（Arth-robacter sp.）。将这些相似性达到98%以上的模式菌株序列，采用软件MEGA7.0进行模式菌同源比对，进而构建系统发育树，结果如图4所示。

从系统发育树上看，菌株ZXY772与Arthrobacter nicot-ianae strain BS23，Arthrobacter nicotianae strain VITNJ6等聚为一簇，构建出的bootstrap达到99%，综合革兰氏染色结果、16S rRNA序列相似性，可鉴定菌株ZXY772为1株节杆菌属细菌（Arthrobacter sp.）。

2.3    菌株的生长曲线及产酶曲线

取种子液依照4%接种至发酵培养基中，置于28 ℃、180 r/min条件下进行摇床振荡培养，每隔一定时间定期取样，测定菌株ZXY772的生物量、产酶活力和pH值。测定产酶活力的半乳糖标准曲线见图5。

菌株ZXY772的生长特性与产酶活性并非成完全正相关（图6），其生长特性与细菌的生长繁殖规律一致，0～3 h时为菌株生长繁殖的延滞阶段，生长极其迟缓;在3 h以后即开始进入菌株生长的对数期;3～14 h期间，菌体生物量快速上升，培养基中发酵液的pH值由7.25升至8.28，猜测是由于培养基组分中的柠檬酸三铵经菌体代谢后产生某种碱性物质;14～33 h处于相对稳定期。其中，当培养21 h时，菌体密度达到最大值;同时在这一时期，培养27 h时，发酵液酶活力升至最大值，酶活力达到96 U/mL。随后发酵液中死亡菌体数逐渐上升，进入了衰亡期，pH值由8.28升至8.81，可能是由于菌体衰亡、自溶导致pH值迅速上升;也可能是由于碳源被利用完，菌体被迫利用胞内有机酸所致。27 h后随着菌体衰亡，死亡菌体数密度逐渐增大，发酵液的产酶活力逐渐降低，酶活力几乎接近0。

2.4    菌株琼胶酶类型的鉴定

将菌株ZXY772发酵得到的粗酶液分别和α-pNPG与β-pNPG混合反应1 h。结果显示，粗酶液与α-pNPG的混合液反应前后在420 nm处的吸光度值均为0.223，无变化;粗酶液与β-pNPG的混合液反应前后在420 nm处的吸光度值分别为0.201、0.234。粗酶液可以作用于含有β-糖苷键的 β-pNPG，未作用于含有α-糖苷键的α-pNPG。由此可推断，该菌株胞外只产β-琼胶酶。

2.5    菌株酶解产物的抑菌结果

利用滤纸片法检测菌株ZXY772的酶解产物对指示菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌活力。数据表明，菌株ZXY772的琼胶酶解产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有较大的抑制圈，对大肠杆菌的抑菌圈直径为6.83 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为7.51 mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌活力最高，透明圈直径达到14.45 mm。

3    讨论

当前，国内外与琼胶酶产生菌相关资料中鲜少有人报导过节杆菌属，其是1株新型的琼胶酶产生菌株。通过结合形态学特征和分子鉴定结果，可判定菌株ZXY772是1株新型的产琼胶酶节杆细菌。其中，相比相同研究领域的琼胶酶酶活：2012年已申请专利的应国清等[24]利用类芽孢杆菌发酵产琼胶酶活力为53.72 U/mL;2014年马芮萍等[12]分离的Stenotrophomonas sp. NTa.，经过改良优化后的琼胶酶活力仅有1.98 U/mL;2017年由张建美等[25]对筛选获得的产琼胶酶菌株Vibrio sp.Ag-1进行发酵优化，其最高酶活仅为45.51 U/mL;2018年Leema Roseline T等[9]对分离得到的琼胶酶菌株Acinetobacter sp. PS12B进行产酶条件优化，酶活由1.52 U/mL增加到45.76 U/mL。本研究经过采用改良后的发酵培养基培养，酶活达到了比较高的水平，稳定在96 U/mL，这在国内外已报道琼胶酶的相关文献中属于较高水平，具有良好的开发前景。琼胶酶水解琼胶得到的产物琼胶寡糖具有良好的抑菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、增强免疫、美白保湿等药理活性，已成为国内外的研究热点。然而，关于琼胶寡糖抑菌作用的相关研究报导较少。本试验从海洋龙须菜上分离筛选获得的琼胶酶产生海洋细菌ZXY772的酶解产物具有较为显著的抑菌活性。相信通过后续优化其发酵工艺，可进一步提高琼胶酶产量;同时对酶解产物的抑菌、抗氧化能力等应用方面深入研究，有望开发应用功能性低聚糖琼胶寡糖。

4    参考文献

[1] WANG J X，MOU H J，JIANG X L.Biological activities of a neutral water-soluble agar polysaccharide prepared by agarase degradation[J].High Tech Lett，2005，11（4）：415-420.

[2] 吳湛霞，董静静，李思东，等.国内江蓠提取琼胶加工工艺的研究进展[J].广西轻工业，2010（9）：19-20.

[3] 谢喜珍，谢金盛，杨捷，等.琼胶寡糖的生物酶解制备工艺研究[J].食品工业科技，2017，38（1）：208-213.

[4] KANG N Y，CHOI Y L，CHO Y S，et al.Cloning，expression and charact-erization of a beta-agarase gene from a marine bacterium，Pseudomonas sp. SK38[J].Biotechnology Letters，2003，25（14）：1165-1170.

[5] CHI W J，PARK D Y，SEO Y B，et al. Cloning，expression，and biochem-ical characterization of a novel GH16 β-agarase AgaG1 from Alteromonas sp. GNUM-1[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（10）：4545-4555.

[6] 修爽，贾馨媛，祖国仁.海洋细菌Vibrio agarivorans-1产琼胶酶培养基优化及其酶学性质[J].大连工业大学学报，2016，35（5）：328-331.

[7] 牟宗娟，李贵阳，茅云翔，等.4株琼胶降解菌的分离、鉴定及产酶条件分析[J].海洋科学，2013，37（4）：13-20.

[8] 刘兴凯，朱丹，史晓娟，等.产琼胶酶细菌Acinetobacter sp. LXK的發酵条件优化[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2018，35（1）：57-65.

[9] LEEMA R T，SACHINDRA N M.Purification and characterization of agarase from marine bacteria Acinetobacter sp. PS12B and its use for preparing bioactive hydrolysate from agarophyte red seaweed gracilaria verrucosa[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2018，186（12）：1-19.

[10] ZHANG L，GUO X F，SONG Y Y，et al.Bioadhesive immobilize agarase on magnetic ferriferous by polydopamine[J].Materials Science & Engin-eering，2018（7）：68.

[11] ROSELINE T L，SACHINDRA N M.Characterization of extracellular agarase production by Acinetobacter junii PS12B，isolated from marine sediments[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2016，6：219-226.

[12] 马芮萍，朱艳冰，倪辉，等.一株产琼胶酶细菌的分离、鉴定及其琼胶酶基本性质[J].微生物学报，2014，54（5）：543-551.

[13] 解卉.产琼胶酶菌株Agarivorans albus QM38的发酵条件优化、酶的分离纯化及酶学性质研究[D].青岛：中国海洋大学，2009.

[14] 刘丽莉，祖国仁.新型产琼胶酶海洋细菌的筛选和鉴定[J].湖北农业科学，2014，53（20）：4831-4834.

[15] 李能章，邱荣蓉，彭远义.琼胶酶的研究进展[J].生命科学研究，2006（增刊1）：62-66.

[16] 周钦茂，谢燕纯，陈彦梅，等.一株高产琼胶酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].生物技术通报，2018，34（12）：140-146.

[17] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[18] 彦繁鹤，周金梅，吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发，2015，36（2）：126-128.

[19] 赵凯，许鹏举，谷广烨.3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J].食品科学，2008（8）：534-536.

[20] 方园.纤维素酶在棉织物生物整理中的应用基础研究[D].杭州：浙江大学，2013.

[21] TEMUUJIN U，CHI W J，CHANG Y K，et al.Identification ang bioche-mical characterization of Sco3487 from Streptomyces coelicolor A3（2），an exo- and endo-type β-agarase-producing neoagarobiose[J].Journal of Bacteriology，2012，194（1）：142-149.

[22] 韩莎莎.琼胶酶高产菌株的选育和红藻寡糖的酶法制备与分析[D].青岛：中国海洋大学，2015.

[23] 吕国强.红藻附生琼胶降解细菌的分离鉴定及HQM9琼胶酶研究[D].济南：山东大学，2011.

[24] 应国清，唐中秀，梅建凤，等.产琼脂酶的类芽孢杆菌及其应用：中国：CN 102559547 A[P].2012-07-11.

[25] 张建美，韩尧跃，王国增，等.海洋弧菌Ag-1产琼胶酶条件研究[J].中国食品学报，2017，17（3）：90-95.