五大连池新期火山熔岩台地不同植被类型土壤微生物量及酶活性变化特征

曹宏杰，王立民，徐明怡，黄庆阳，罗春雨，谢立红，倪红伟

（1.哈尔滨师范大学 地理科学学院，黑龙江 哈尔滨 150025；2.黑龙江省科学院自然与生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150040）

土壤微生物作为土壤生态系统重要的活性组成部分，是评价土壤质量的重要指标之一，其参与生态系统物质循环和能量流动，在调控生物地球化学循环过程和维持生态系统功能方面起着关键作用[1-3]，直接或间接影响植物生长，促进植被的演替。对生态系统演替过程的研究表明，土壤微生物对生态系统的发展具有重要的促进作用[4]。土壤酶是土壤生态系统最活跃的有机组分之一，由土壤细菌、真菌和古菌产生的胞外酶参与无数的生物地球化学过程，是陆地生态系统有机质产生、固持、扰动和土壤养分循环的核心[5]。其活性在土壤中的表现，在一定程度上反映了土壤所处的状况，且对环境等外界因素引起的变化较敏感，成为土壤生态系统变化的预警和敏感指标[6]。植被演替等环境条件的改变会对微生物数量、活性和群落组成产生直接的影响，进而影响土壤酶活性[7]。

五大连池火山自然保护区，位于黑龙江省黑河市西南部，地处小兴安岭西南山麓与松嫩平原的过渡地带，是我国保存最为完好的内陆单成因火山群。最近的一次火山喷发活动发生在1719—1721年，期间经历多次大量的高钾玄武质熔岩流喷溢活动。灼热的喷发物破坏土壤，影响土壤发育和水土流失状态，喷发物冷却后形成的火山熔岩、浮石营养物质缺乏，尤其是氮缺乏，不能满足植物生长所必需的养分，造成植被演替缓慢[8]，植被更新演替及生物地球化学循环都发生了改变[9-10]。近年来，国内一些学者对该区域植被演替、物种组成、植物多样性及植物功能性状[11-14]等方面做了大量研究，而对微生物量及酶活性的研究较少[15]。土壤微生物和土壤酶是火山生态系统重要的组成部分，其与植物生长之间存在必然的内在联系，植被类型是影响土壤水解酶活性的关键因子之一。不同植被条件下土壤微生物通过酶催化分解大分子有机物为可溶性的养分，供微生物同化利用[16]，影响着植物群落有机质周转[17]，在新期火山环境和植被演替过程中的作用尤其明显。五大连池新期火山熔岩台地因基质条件、熔岩产状等因素的影响，随机分布这苔藓地衣、草本群落、灌丛、矮曲林以及针阔混交林等不同类型的植被，不同类型植被下土壤微生物量及酶活性尚不清楚。本研究对五大连池新期火山熔岩台地不同植被类型土壤微生物量及酶活性进行研究，旨在探讨原生演替过程中不同阶段土壤微生物量及酶活性的差异和变化规律，为新期火山熔岩台地土壤微生物与环境因子的协同进化关系研究提供依据。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

实验地点位于五大连池火山自然保护区，区内设有黑龙江黑河（五大连池）国家森林生态系统定位观测研究站。保护区位于黑龙江省黑河市西南部，地处小兴安岭西南山麓与松嫩平原的过渡地带。地理位置126°00′～126°45′E，48°30′～48°50′N，总面积988.66 km2（图1）。属温带大陆性季风气候区，冬季严寒漫长，夏季凉爽短促。年平均气温-0.5℃，无霜期121 d，年平均降水量476.33 mm，年平均相对湿度69.2%。

由于五大连池老黑山喷发时间距今只有300年，熔岩风化速度缓慢，熔岩台地微地形复杂，还未形成明显的土壤层次，不同植被类型的植物呈随机性分布，受周边环境影响，处于不同演替阶段植物群落均有分布，主要植被类型有:地衣-苔藓群落、草本植物群落、灌木群落、矮曲林群落及针阔混交林群落等。

1.2 研究方法

1.2.1 样地设置和样品采集

2017年6月选取苔藓（Moss）、草本（Herb）、灌丛（Shrub）、矮曲林（Dwarf forest，D-Forest）和针阔混交林（Conifer and Broadleaf Mix Forest，C&B-Forest）5 种典型的植被类型，每种植被类型设置3 块样地，苔藓地衣、草本和灌丛样地面积约100 m2，矮曲林和针阔混交林样地面积约400 m2，样地基本特征见表 1。在每个样地设3 个1 m×1 m 的小样方进行草本层群落调查。同时在每个小样方内设置梅花状采样点，每个样方采集5 点0～10 cm 土壤，混合为1 个土样。样品剔除植物碎屑后过2 mm 筛，一部分样品4 ℃保存，用于土壤微生物生物量和酶活性等指标的测定。一部分样品风干过2 mm 筛，用于测定土壤理化性质。

图1 研究区位置及其概况Fig.1 Location and basic information of experiment sites

表1 不同植被类型的样地特征Table 1 Site characteristics of different vegetation types

1.2.2 土壤理化性质的测定

土壤理化性质测定参照鲁如坤主编的《土壤农业化学分析方法》[18]和《中华人民共和国林业行业标准LY/T1210-1275-1999》[19]。土壤pH值用水浸提电位法（水土比为2.5∶1）；土壤总有机碳（Total organic carbon，TOC）和全氮（Total nitrogen，TN）采用元素分析仪测定（欧唯特 EA3000）；铵态氮（Ammonium nitrogen，-N）、硝态氮（Nitrate nitrogen，-N）采用流动分析仪测定（SKALAR SAN++）；全磷（Total phosphorus，TP）和有效磷（Available phosphorus，AP）采用钼锑抗比色法。

1.2.3 微生物量碳、氮和磷的测定

称取经7 d 预培养的土样30.000 g 3 份分别装入100 mL 烧杯，并和盛有50 mL 氯仿和50 mL 1 mol·L-1NaOH 的烧杯同时置入干燥器，用真空泵抽至氯仿沸腾并保持5 min，后密封置于25℃恒温箱中熏蒸24 h。熏蒸结束后，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气直至土壤无氯仿味后用于微生物量的测定。将熏蒸土样用0.5 mol·L-1K2SO4溶液震荡浸提用于微生物量碳、氮测定或用0.5 mol·L-1NaHCO3（pH 值8.5）溶液震荡浸提用于微生物量磷的测定。在进行熏蒸的同时称取同样质量（30.000 g左右）的土样3 份浸提和测定，为不熏蒸对照。微生物量碳氮用总有机碳氮分析仪测定（耶拿 multi C/N 2100s），微生物量磷用分光光度计测定（赛默飞 Evolution 300）[20-22]。

1.2.4 土壤酶活性的测定

测定的土壤酶为：α-1,4-吡喃葡萄糖苷酶（α-1,4-glucopyranosidase,αG），β-D- 葡萄糖苷酶（β-1,4-glucopyranosidase,βG），纤维二糖水解酶（β-D-cellobiohydrolase,CB），β-1,4- 木糖苷酶（β-1,4- xylopyranosidase,XYL），β-1,4-N- 乙酰基氨基葡萄糖苷酶（β-1,4-N-acetylglucosaminidase,NAG），亮氨酸氨基肽酶（L-Leucine aminopeptidase,LAP） 和磷酸 酶（Phosphatase,PHOS）。

将2.75 g 的土壤样品与91 mL 50 mmol 醋酸钠缓冲液（pH 值6.8）在组织捣碎机上均质化1 min，制成土壤悬浊液。

取200 μL 的土壤悬浊液加入到96 孔黑色微孔板中（每个样品做6 个平行），样品微孔中加入50 μL 200 μmol·L-1底物，空白微孔中加入50 μL超纯水和200 μL 的土壤悬浊液，阴性对照微孔中加入50 μL 底物和200 μL 的超纯水，淬火标准孔中加入50μL标准物质（10 μmol·L-1MUB 或MUC）和200 μL 的样品悬浊液，参考标准微孔中加入50 μL 标准物质和200 μL 超纯水，每个样品的空白、阴性对照、淬火标准和参考标准做6 个平行，微孔板于25 ℃避光条件下培养3 h，培养结束后在每个微孔中加入10 μL 0.5 mol·L-1的氢氧化钠溶液中止反应，静置1min 后用酶标仪测定（Biotek Cytation 5），激发光波长为365 nm，发射光波长为450 nm。具体方法见参考文献[23-24]。

1.3 数据处理

数据处理和作图采用SPSS 20、OriginPro8.5以及Microsoft Excel 2016 软件进行。

土壤微生物量计算：土壤微生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）=（Ec-Ec0）/ 0.38；土壤微生物量氮（Soil microbial biomass nitrogen，SMBN）=（Ec-Ec0）/0.54；土壤微生物量磷（Soil microbial biomass phosphorus，SMBP）= (Ec-Ec0)/0.40；其中Ec 为熏蒸土样浸提液中碳、氮或磷量，Ec0 为不熏蒸土样浸提液中碳、氮或磷量，0.38、0.54 和0.40 为校正系数。

土壤酶活性计算：

式中：Ab为土壤样品的酶活性（nmol·g-1dry soil·h-1）；F为校正后的样品荧光值；V为土壤悬浊液的总体积（91 mL）；v1为微孔板每孔中加入的样品悬浊液的体积（200 μL）；t为培养时间（3 h）；m为干土样的质量（2.75 g 新鲜土样换算成干土的结果）；f为酶标仪读取样品微孔的荧光值；fb为空白微孔的荧光值；q为淬火系数；fs为阴性对照空的荧光值；e为荧光释放系数；fr为参考标准孔的荧光值；cs为参考标准孔的浓度（10 μmol·L-1）；v2为加入参考标准物的体积（0.05 mL）；fq为淬火标准微孔的荧光值。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物量的变化

土壤微生物是植物所需营养物质循环和转运的重要组成部分[25]，是土壤活性养分的重要储存库，是植物生长可利用养分的重要来源[26-27]。由图1可知，苔藓地衣群落的微生物量碳最低，与其它植被类型之间差异显著（P＜0.05）（图2-A），灌木群落和矮曲林的微生物量碳和氮无显著差异（图2-A,B），除针阔混交林外其它4 种植物类型微生物量磷均无显著差异（图2-C）；针阔混交林的微生物量最高，与其它植被类型间差异显著（P＜0.05）；不同植被类型土壤微生物量碳、氮和磷含量均呈现逐渐增加的趋势。

2.2 微生物量对土壤营养库的贡献率

由图3可知，不同植被类型土壤微生物量对土壤营养库的贡献率存在一定的差异，并且随演替的进行逐渐增加，微生物量碳与土壤有机碳比值的变化趋势强于微生物量氮与土壤全氮和微生物量磷与土壤全磷的变化趋势；苔藓地衣群落微生物量对土壤养分库的贡献均低于其它植被类型，草本群落和灌木群落微生物量对土壤养分库的贡献率没有显著差异，针阔混交林的微生物量磷与土壤全磷比值显著高于其它群落（P＜0.05）（图3-C）。

2.3 土壤酶活性的变化

图2 不同植被类型土壤微生物量碳、氮和磷含量Fig.2 Soil microbial biomass carbon,nitrogen and phosphorous in different vegetation types

图3 不同植被类型土壤微生物量对土壤营养库的贡献率Fig.3 Contribution rate of soil microbial biomass to soil nutrient bank in different vegetation types

由图4可知，不同植被类型下七种土壤酶活性均存在差异，苔藓地衣和草本群落与碳循环相关的酶活性无显著差异，但均低于灌木群落、矮曲林群落和针阔混交林群落的酶活性，差异显著（P＜0.05）（图4-A，B，C 和D）；草本群落NAG 和PHOS 的活性也低于其它植被类型；除αG 活性外，针阔混交林的酶活性均处于最高水平；CB、XYL、LAP 和PHOS 的活性随演替的进行呈逐渐增加的趋势。

图4 不同植被类型土壤酶活性Fig.4 Soil enzymes acquisition activity in different vegetation types

2.4 微生物量与酶活性的相关性

由表2可知，土壤微生物量碳和氮与酶活性之间均具有极显著的正相关关系（P＜0.01）。微生物量磷与NAG 和PHOS 活性之间也存在极显著的正相关关系（P＜0.01），而与其它5 种酶之间相关性不明显。

2.5 微生物量及酶活性与土壤环境因子的冗余分析

2.5.1 微生物量碳、氮和磷与土壤环境因子的冗余分析

5 种植物类型土壤微生物量碳、氮和磷与土壤环境因子的冗余分析表明，前两个排序轴共解释了72.58%的土壤微生物量信息和99.88%的土壤微生物量与土壤环境因子的关系（图5-A）。土壤全氮、全磷和硝态氮与第一排序轴呈负相关，与第二排序轴呈正相关；pH 值与第一排序轴呈正相关，与第二排序轴呈负相关；土壤总有机碳、速效磷、铵态氮和C∶N 与第一和二排序轴呈正相关。土壤微生物量与土壤总有机碳、速效磷、铵态氮和C∶N 具有显著地正相关关系。

表2 土壤微生物量与酶活性的相关性†Table 2 The correlation between soil microbial biomass and soil enzyme acquisition activity

2.5.2 酶活性与土壤环境因子的冗余分析

由图5-B 可知，前两个排序轴共解释了72.18%的土壤酶活性信息和94.71%的土壤微生物量与土壤环境因子的关系。土壤全氮和硝态氮与第一排序轴呈负相关，与第二排序轴呈正相关；pH 值、速效磷和C∶N 与第一排序轴呈正相关，与第二排序轴呈负相关；土壤全磷与第一和二排序轴呈负相关；土壤总有机碳和铵态氮与第一和二排序轴呈正相关。αG、βG、CB、XYL 和LAP与土壤铵态氮具有显著的正相关关系；NAG 和PHOS 与速效磷和C∶N 具有显著的正相关关系，与硝态氮具有显著的负相关关系。

图5 土壤微生物量及酶活性与土壤环境因子的冗余分析Fig.5 RDA of soil microbial biomass,soil enzyme acquisition activity and environmental variables of soil

3 讨 论

3.1 土壤微生物量与植被类型的关系

不同植物类型可以代表不同的演替阶段，由于地表覆盖状况与物种组成不同，影响生态过程及养分循环，决定着植被演替的发展方向与速度，从而导致生态系统结构功能的改变[28]。微生物作为生态系统的重要组成部分，其群落结构和数量必然会受到影响。研究表明，在生态系统恢复或发育初期土壤微生物量的值呈增加趋势[29]，土壤微生物量会随着生态系统恢复年限增加而增加[30-31]，这些与本文的研究结果一致，这说明在相对较短的时间尺度上在植物群落一个演替过程中土壤微生物量的变化趋势具有相似性[32]。根源在于原生演替过程中，在演替初期，地表裸露较大土壤微生物的繁殖代谢受到强烈干扰，造成演替初期微生物量的含量显著低于其它演替阶段。随着演替的深入植被凋落物的数量会逐渐增加，为微生物的生长提供丰富的碳源，植物根系也会分泌更多的次生产物供微生物利用，并改善根际微环境，促进微生物繁殖，因此，随着演替的进行微生物量呈逐渐增加的趋势。

尽管土壤微生物量碳只占土壤有机碳的1.92%左右[33]，但其在生态系统的能量流动和物质转化中却起着重要的作用[25]。Jenkison[34]认为，在分析土壤微生物量绝对含量的同时，还应该考虑微生物量碳和微生物量氮在土壤有机碳和全氮中的比例，因为在无外界干扰的情况下，土壤微生物量并不能完全反映土壤微生物的功能、结构和活性。土壤微生物量对土壤营养库的贡献率反映了土壤单位营养所负载的微生物量，贡献率高说明有较多矿物质被微生物固定，是潜在的有效营养源；贡献率低说明微生物具有潜在固定矿物质的能力，成为潜在的营养库。本研究中，不同植被类型土壤微生物量对土壤营养库的贡献率存在一定的差异，并且具有明显的变化趋势，即随演替的深入逐渐增加，说明随着演替的进行土壤微生物量具有增加趋势，可以为植物生长提供更多的有效养分。矮曲林和针阔混交林的微生物量碳和微生物量氮对土壤养分的贡献率没有明显的差异，说明随着生态系统恢复年限的增加，微生物量达到一个最大值后会呈现一个相对稳定的状态[28]。

3.2 土壤微生物量与酶活性的关系

本研究中熔岩台地不同植被类型土壤微生物量与土壤酶活性之间具有显著的正相关关系（表2）。研究表明，土壤微生物的数量和组成不同，会引起土壤酶活性在质和量上的差异[35]，同时土壤微生物对土壤有机质的分解及养分循环受到土壤环境中胞外酶的调节，微生物在代谢过程中通过和胞外酶之间建立的养分元素、能量物质传输与土壤、植被和大气间完成物质能量循环过程[36]，而且，微生物对无机盐的吸收需要通过胞外酶的调控[37]，胞外酶在传递微生物与外界物质、能量交换中起着关键作用[38]，说明土壤酶活性与土壤微生物生物量间有着不可分割的关系[39]，

3.3 土壤酶活性与植被类型的关系

α-1,4-吡喃葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、β-1,4-木糖苷酶，β-1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶和磷酸酶分别能够表征土壤C、N 和P 的供应程度，土壤酶活性是土壤质量、生态环境效应评价中极为重要的指标之一[40-42]。土壤酶系统是土壤中生物活性最强的部分，其与植物生长之间存在必然的内在联系，植被类型是影响土壤水解酶活性的关键因子之一。熔岩台地植物演替过程中，不同植被类型的植被条件存在显著差异，凋落物数量和质量不同，导致土壤有机碳数量和质量不同，从而改变土壤微生物可以利用C、N、P 等底物和养分的数量和质量，而土壤中微生物通过酶催化分解大分子有机物为可溶性的养分，供微生物同化利用[16]，影响着不同植物群落有机质周转[17]，进而影响土壤酶活性[43]。因此，营养物质周转能力和微生物同化能力的差异可能是土壤酶活性在不同植被类型存在差异，且呈现一定的规律性的原因。

3.4 土壤微生物量与土壤环境因子的关系

土壤微生物量是土壤有机质中最活跃和最易变化的部分，极易受土壤环境因子的影响，其含量与土壤类型和植被等有关[44]。由于不同植被类型地表覆盖状况、物种组成与结构不同，影响微生物代谢和繁殖的影响因素存在差异，从图5-A 不同植被类型样点在图中的分布可以看出，影响不同植被类型的土壤因子存在显著的差异，苔藓地衣、草本群落和灌木群落更易受土壤全磷、全氮和硝态氮的影响，而针阔混交林的主要影响因子包括土壤有机碳、铵态氮、速效磷和C∶N，说明不同的植被类型生态过程、养分循环及演替方式可能存在差异，进而导致生态系统结构功能发生响应的改变。因此可以认为，不同植被类型使得土壤理化因子对土壤微生物量的影响程度存在差异。从图5-A 还可以看出，土壤有机碳和C∶N 与微生物量存在显著的正相关关系。研究表明，土壤有机碳控制着土壤中能量和营养物质的循环，是微生物群落稳定的能量和营养物质来源，是微生物量形成的重要控制因素[45]，微生物在代谢过程中除利用碳源外还需要吸收相应比例氮[46]。氨态氮含量和C∶N 与土壤微生物量之间已存在显著的相关性，说明火山熔岩台地在土壤发育过程中，初期积累的碳显著高于氮，氮素也可能成为土壤中微生物生长的限制因素[47]，因此后续需要开展氮素添加实验来进行验证。

3.5 土壤酶活性与土壤环境因子的关系

土壤微生物和植物分泌的胞外酶是土壤有机质分解的关键媒介，是细胞代谢的产物，其活性与产量和土壤碳底物及氮、磷养分有效性密切相关[48-50]。本研究中，影响酶活性的关键因素是土壤铵态氮、C∶N、速效磷和和硝态氮，同时磷酸酶活性受pH影响较大。研究表明，在岩溶生态系统中，磷是决定土壤生产力和功能结构的关键要素，对土壤细菌生物量具有显著影响[51]，但岩溶区全磷不易转化为速效磷，有效性又较低[52]，当微生物存在磷限制时，微生物就会分泌更多的磷酸酶促进土壤有机磷矿化，缓解自身的磷限制[43]。由于研究中只对全磷和速效磷进行了分析，不同磷素组成及活性对土壤酶活性的影响如何还不清楚需要作进一步的探讨。同时，土壤酶活性也会受到土壤养分化学计量比的影响，其可能原因是土壤酶主要来源于土壤微生物、植物根系分泌、植物降解的产物以及动物残体[53]，微生物生物量化学计量比随土壤和植物组织养分化学计量比的改变而改变，而土壤酶活性与土壤微生物量之间存在显著的相关性，因此土壤酶活性亦能够受土壤养分化学计量比的影响[49]。而土壤pH 主要通过影响土壤微生物生物量和群落组成、酶的空间构象以及酶与土壤颗粒之间的结合状态，从而调控土壤酶活性[54]。

4 结 论

随着演替的进行，土壤微生物量和土壤微生物量对土壤营养库的贡献率均随演替的深入逐渐增加；不同植被类型土壤微生物量与土壤酶活性之间具有显著的正相关关系；土壤酶活性在不同植被类型间存在差异，酶活性总体表现为：针阔混交 林＞矮曲林＞灌丛＞苔藓＞草本，营养物质周转能力和微生物同化能力的差异可能是造成上述差异的主要原因；不同植被类型土壤微生物量和酶活性受土壤环境和土壤养分的影响程度存在明显差异，土壤pH 值、土壤全磷、速效磷、土壤全氮和速效氮对土壤微生物量和酶活性均具有显著影响。

同时，植被类型通过改变微生物的生存环境来影响土壤微生物生物量、群落组成和结构进而影响土壤酶活性，因此后续研究需要对影响微生物生存环境的因素进行细致研究并结合Biolog 方法、酶动力学、分子生物学尤其是高通量测序等手段，深入研究生态系统演化过程中地上植被类型、组成、多样性以及根系分泌物等与土壤微生物结构、功能以及酶活性的关系，阐明植被演替进程对土壤微生物群落结构和功能、酶活性的相对作用。