HPLC特征图谱法比较去节麻黄与麻黄节的差异

安俐瑶,姜英子*,徐雅娟,解生旭,刘悦

(1.延边大学，吉林 延吉 133000；2.吉林省中医药科学院，吉林省中药药效物质基础重点实验室，吉林 长春 130021)

麻黄为麻黄科麻黄属植物草麻黄(EphedrasinicaStapf)、中麻黄(EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(EphedraequisetinaBge.)的干燥草质茎[1]。麻黄辛温，味微苦，入肺、膀胱经，具有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿之功效[2]。关于麻黄的修治，最早见于张机的《金匮玉函经》：“麻黄，折去节，令通理，寸剉之，寸剉不如碎剉，如豆大为佳[3]。北京西鹤年堂将麻黄炮制成“鱼子样”以分类“去节麻黄”与“麻黄节”[4]。雷公云：凡使，去(根)节并沫，若不尽，服之令人(心)闷[5]。《桂林古本伤寒杂病论》中共载方剂四百余，用麻黄的方剂共29首，其中备注“去节”的方剂共14首[6]。可见“麻黄去节”在古代是必不可少的炮制工序。

以《伤寒论》中的“麻黄汤”与“射干麻黄汤”为例，分析麻黄去节与否的作用。麻黄汤记载“麻黄(去节)”，主治太阳病，头痛发热，身疼腰痛，骨节疼痛，恶风，无汗而喘[7]。麻桂并用，增强麻黄的发汗作用，此中重用麻黄发汗解表之功，以治表为主；射干麻黄汤未做“去节”标注，则按照不去节入药。其具有化痰利咽，清肺降气之功，此中重用麻黄宣肺平喘之功，以治里为主[8]。故可大概推测，古人用麻黄，发汗解表多去节，宣肺平喘不去节。

有学者用气相色谱法对麻黄全草、节、去节各部位的主成分进行含量测定，结果表明，总麻黄碱的含量为，去节>全草>节[9]。近年来也有学者使用UPLC-Q TOF MSET探究麻黄蜜炙、酒制、醋制和炒炭的化学成分变化[10]。还有学者用指纹图谱及PCA和CA法分析不同地区及正品、伪品麻黄药材的质量差异，但是尚未系统研究麻黄去节与否的区别[11-12]。笔者建立15批去节麻黄和麻黄节的高效液相色谱(HPLC)特征图谱，并采用聚类分析法(CA)和主成分分析法(PCA)对两种炮制品进行分析。在特征图谱的结果中去节麻黄被标记出6个共有峰，麻黄节样品被标记出10个共有峰。CA结果中将两种炮制品分为2类，PCA结果显示，去节麻黄筛选出累计贡献率达到85.634%的3个因子，麻黄节筛选出累计贡献率达到83.976%的4个主成分。这说明了“去节麻黄”与“麻黄节”之间的差异，证明麻黄“去节”有炮制的必要，为后续开发复方中带有“去节麻黄”的传统制剂提供参考。

1 材料

Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；水为娃哈哈纯净水；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。盐酸麻黄碱对照品(批号：171241-201007，中国食品药品检定研究院)；盐酸伪麻黄碱对照品(批号：171237-201208，中国食品药品检定研究院)。

麻黄药材共收集15批样品，根据《中国药典》2015年版(一部)麻黄的含量测定方法，测定药材中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱(以下简称总碱量)的含量，结果显示：15批麻黄药材总碱量均大于0.8%，全部符合药典标准；所有去节麻黄的总碱量均大于麻黄节的总碱量。其中12批“去节麻黄”的总碱量接近“麻黄节”的总碱量的2倍，结果见表1。

表1 麻黄两种供试品的总碱量

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 药材的前处理 将麻黄药材的节和节间分开，节的前后可留一小部分，所留部分应尽量小。两种炮制品粉碎后过5号药典筛。

2.1.2 指纹图谱供试品溶液的制备 取“2.1.1”项下所得的样品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，称定重量，超声处理(功率600 W，频率50 Hz)20 min，放冷，再称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定盐酸麻黄碱对照品4.9 mg，盐酸伪麻黄碱对照品4.4 mg以甲醇溶解，混合定容于100 mL容量瓶中。

2.3 HPLC指纹图谱测定及共有峰鉴定

2.3.1 HPLC指纹图谱色谱条件 Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1；进样量10 μL；流动相A：0.05%磷酸—0.05%三乙胺溶液，B：乙腈；梯度洗脱(0～4 min，2%→2% B；4～12 min，2%→4%B；12～28 min，4%→6%B；28～45 min，6%→9%B；45～60 min，9%→12%B；60～85 min，12%→18%B；85～87 min，18%→2%B)；波长210 nm。

2.3.2 HPLC指纹图谱采集与分析 分别按照“2.3.1”项下条件分析混合对照品溶液和15批“麻黄节”供试品与“去节麻黄”供试品溶液，记录87 min图谱，混合对照品溶液HPLC色谱图见图1,15批去节麻黄HPLC色谱图见图2，15批麻黄节HPLC色谱图见图4。

15批麻黄节和去节麻黄的特征图谱显示，由对照品指认的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的特征峰均比较稳定，其中盐酸伪麻黄碱峰面积适中，分离度较好，因而被选为参照峰(S)。将二者的特征图谱分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”软件，以S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.5 s，进行多点校正，全谱峰匹配后以中位数法生成2个共有模式图谱，其中15批去节麻黄的共有模式图谱见图3，共6个共有峰；15批麻黄节的共有模式图谱见图5，共10个共有峰。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2。

1.盐酸麻黄碱；2.盐酸伪麻黄碱

1.盐酸麻黄碱；2.盐酸伪麻黄碱

3.盐酸麻黄碱；4.盐酸伪麻黄碱

1.盐酸麻黄碱；2.盐酸伪麻黄碱

4.盐酸麻黄碱；5.盐酸伪麻黄碱

2.3.3 指纹图谱的方法学考察

2.3.3.1 精密度试验 精密称取编号6的去节麻黄样品和麻黄节样品0.5 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下条件进行HPLC分析，连续测定6次，测定记录色谱图，以参照峰的保留时间和峰面积为参比，结果见表3，可知该方法精密度好。

表2 15批去节麻黄与麻黄节指纹图谱共有峰的相对峰面积与相对保留时间RSD值

2.3.3.2 重复性试验 精密称取编号6的去节麻黄和麻黄节样品，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进行HPLC分析，结果见表3，由表可知该方法重复性良好。

2.3.3.3 稳定性试验 按“2.1.3”项下方法制备麻黄节和去节麻黄供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”项下条件进行HPLC分析，24 h内结果见表3，由表可知该方法制备的供试品溶液在24 h内稳定。

表3 方法学的RSD值

2.3.4 15批麻黄药材相似度评价 以15批麻黄节和去节麻黄药材共有模式图谱为标准，进行整体相似度评价，15批去节麻黄药材的相似度为0.879～0.994，15批麻黄节药材的相似度在0.895～0.996，结果见表4。

2.3.5 聚类分析 使用SPSS 22.0软件对30批样品(其中1～15号为去节麻黄样品，16～30号麻黄节)进行系统聚类分析，采用组间连接法，得到聚类树状图，见图6。

图6显示当类间距离介于15～20时，去节麻黄和麻黄节可以被明显地聚为2类。

2.3.6 主成分分析 采用SPSS 22.0软件，以绝对共有峰面积为变量，分别计算主成分特征值、贡献率及累积贡献率。选取特征值>1,主成分累计贡献率>70%以上者，由表5～6、图7～8可看出，去节麻黄中前3个主成分能代表去节麻黄特征图谱，而麻黄节中前4个主成分能代表麻黄节特征图谱。

表4 15批去节麻黄与15批麻黄节的指纹图谱相似度

图6 15批去节麻黄和15批麻黄节的聚类树状图

表5 去节麻黄特征值表

表6 麻黄节特征值表

图7 去节麻黄特征值散点图

图8 麻黄节特征值散点图

竖读表7和表8发现去节麻黄和麻黄节因子载荷矩阵中因子1在多数共有峰的上有较大的载荷。因此，两种炮制品中的因子1可初步确定为综合因子，即认为主成分1可以反映两种炮制品特征图谱较全面的信息。由表9可知因子1中3号共有峰得分系数的绝对值最高，因此，去节麻黄的主成分分析中，与因子1最密切的共有峰为3号共有峰。由表10可以知主成分1中2号共有峰得分系数的绝对值最高，与之相近的是9号共有峰。因此，与主成分1最密切的共有峰为2号共有峰，9号共有峰也值得关注。

表7 去节麻黄主成分因子载荷矩阵

表9 去节麻黄主成分得分系数矩阵及保留时间

表10 麻黄节主成分得分系数矩阵及保留时间

3 讨论

3.1 色谱柱考察 考察了Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和 Phenomenex Polar-RP 80A(4.6 mm×250 mm,4 μm)色谱柱。结果显示，使用Phenomenex Polar-RP 80A色谱柱时麻黄碱和伪麻黄碱2个对照峰分离效果优于Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，但是其余成分分离效果不好，无法体现指纹图谱的特征性，因此采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱。

3.2 流动相和检测波长的考察 分别考察了210 nm下使用磷酸和甲酸、260 nm下使用磷酸和甲酸的条件。发现使用甲酸时检测波长在210 nm时紫外吸收较大，基线不平稳，干扰特征图谱生成，但波长在260 nm时无论使用甲酸或者磷酸麻黄碱和伪麻黄碱两个对照峰不明显，因此最终使用磷酸-210 nm作为流动相。后续考察了磷酸浓度为0.05%和0.1%时的峰谱，当酸水浓度从0.1%浓度的磷酸溶液降到0.05%时，36 min处原本上浮的基线下降，这使得峰面积更加准确，成分分离效果更好。

3.3 供试品提取方法考察 考察了磷酸超声提取和水煎煮提取，结果显示，二者所能提取的主要物质基本相同，但是磷酸超声能提取出较多的生物碱类成分，在水煎液的指纹图谱中杂质较多，影响主成分的有效分离。因此最终选择磷酸超声提取。

3.4 相似度分析 依据本研究的测定方法，15批麻黄药材的特征图谱基本吻合，其中14批药材的相似度大于0.9，仅有1批来自吉林瞻榆朝阳村的药材无论是节与去节的供试品相似度均小于0.9，表明该地区药材质量可能存在质量不稳定情况。

3.5 聚类分析和主成分分析 PCA过程会自动生成各因子的权重，可较大程度上抵制人为评价的干扰；CA能够找到隐藏在众多共性下的差异，两者结合分析使分析的结果更加客观。CA结果显示，15批麻黄样品并未完全按照产地分别聚类，不同产地的药材仍有共性，这说明麻黄药材并未因地域分布而存在较大差异，这可以保证大生产时投料的稳定性。PCA结果显示，去节麻黄中前3个主成分能代表去节麻黄特征图谱，而麻黄节中前4个主成分能代表麻黄节特征图谱，这说明麻黄节中所含物质较去节麻黄多。在去节麻黄中与主成分1最密切的共有峰是3号峰即盐酸麻黄碱峰，而麻黄节中显示与主成分1有密切关系的峰为2号峰和9号峰，并非由对照品指认的峰。由此可推断，去节麻黄样品主要发挥作用的化学成分应为麻黄碱类物质，麻黄碱类物质可以兴奋β受体引起发汗，这与前述的功效推断相吻合[13-14]。

4 小结

本文首次建立特征图谱并采用聚类分析与主成分分析法对去节麻黄与麻黄节做了系统对比，特征图谱按照“节与去节”将两种炮制品聚成两个亚类，这说明二者在成分上有明显差别，同时也说明麻黄在使用时需做去节炮制的必要性。聚类分析时关于药材产地的聚类不明显，由此推测是每个产地的药材批次数量不足的缘故。建议以后的学者可使用更多批次的药材进行特征图谱的考察，并建立更便捷高效的方法。主成分分析时，发现在去节麻黄样品中3号共有峰(盐酸麻黄碱峰)是影响其特征图谱的主要色谱峰，而麻黄节样品中影响其特征图谱的主要色谱峰是2号共有峰和9号共有峰，因此证明了以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量作为评价麻黄质量的指标是片面的。