改良PCR-RFLP法检测MTHFR基因C677T位点多态性

何震宇,顾取良,游娟

(广东药科大学生物化学与分子生物学系，广东 广州 510006)

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢途径的关键酶，其编码基因定位于1p36.3[1],全长2.2 kb，包含11个外显子[2]。MTHFR基因错义突变是引起酶活性缺乏和降低的主要机制，最常见的一个突变是DNA分子第677位碱基发生C→T 的突变(C677T)，它会导致编码肽链第222位的丙氨酸被缬氨酸取代，从而降低MTHFR的热稳定性和活性,杂合子(TC)个体的MTHFR活性降低35%，突变纯合子(TT)个体的MTHFR活性降低70%[3]。MTHFR活性下降可引起血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平上升、一碳单位代谢障碍，与唐氏综合征[4]、神经管缺陷[5]、唇腭裂[6]、心脑血管疾病[7]、自闭症[8]、反复自然性流产[9]、肿瘤[10]等多种疾病的发生相关。加强MTHFRC667T基因分型研究，对临床疾病诊断、风险性预测及指导医生用药等有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

口腔拭子基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；2×HS PCR Mix(广州东盛生物科技有限公司)；上游引物FP：5′-CTGGGGTCAGAAGCATATCAGTCATG-3′及下游引物RP：5′-AAGCAACGCTGTGCAAGTTCTGG-3′(自行设计，北京六合华大基因科技股份有限公司合成)；HinfI(Thermo Fisher Scientific Inc)；DNA分子量标准low ladder(广州东盛生物科技有限公司)。

1.2 主要仪器

5804R型低温高速离心机(德国Eppendorf 公司)；DDY- 6c型电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像分析仪(英国 Syngene 公司)；2720型PCR仪(美国ABI公司)。

1.3 研究对象

正常口腔拭子标本100例，采自广东药科大学在读本科生，其中男57例，女43例，平均年龄20.28岁，事先均签署了知情同意书。

1.4 DNA制备

准备消毒的医用棉签，志愿者先用清水漱口，然后手持棉签伸进口腔，在口腔内侧(腮帮子)上反复擦拭10次左右，取出棉签，-20 ℃保存。……