HSPA13在ARPE19细胞氧化应激中的作用

李梦雯， 吕亚莉， 徐国彤， 吕立夏

(1. 同济大学医学院再生医学系生物化学与分子生物学教研室，上海 200092; 2. 同济大学附属第十人民医院眼科，上海 200072)

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)，也称老年性黄斑变性，是全世界老年人失明的主要原因之一[1]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞的氧化损伤和慢性炎症被认为是AMD的发展过程中重要的影响因素[2-3]。应激分子伴侣也称为HSPA13，是热休克蛋白家族的一员，由钙离子诱导[4]。活性氧类(reactive oxygen species, ROS)导致细胞内钙离子超载，引发细胞凋亡[5-6]。

细胞内钙离子水平升高诱导HSPA13基因的表达上升，因此，本研究探讨HSPA13在氧化应激诱导的人视网膜上皮ARPE19细胞中的表达情况，以及HSPA13的表达水平对氧化应激诱导的ARPE19细胞中相关氧化应激指标和促炎因子的影响；并在干扰HSPA13表达后进行RNA测序，对差异表达的基因进行基因本体(gene ontology, GO)分析及京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路分析，为进一步探索HSPA13在AMD中的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

DME/F12培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；链霉素及青霉素、CCK8试剂盒、丙二醛(malondialdehyd，MDA)试剂盒、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)检测试剂盒购自碧云天公司；3%H2O2购自美国Sigma公司；anti-HSPA13、anti-β-actin、二抗购自Proteintech公司；TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β ELISA试剂盒购自美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 使用DME/F12基础培养基，添加10%的胎牛血清和500μL的青霉素链霉素双抗，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养人ARPE19细胞。

1.2.2 CCK8法测定细胞活力的改变 实验前使用细胞培养基配制H2O2处理液，以2×104/mL的密度将ARPE19细胞接种在96孔板中，细胞贴壁后，分别添加含终浓度为10、25、50、100、200、300、400μmol/L H2O2的细胞培养基处理细胞，处理4h。将体积分数为10%的CCK8工作液加入H2O2空白对照组(不含H2O2的细胞培养组)、各浓度H2O2处理组和只含培养基的无细胞对照组中，将细胞培养板置于37℃恒温培养箱30min。随后在450nm波长处检测各孔的光密度值(D450)。每组设6个复孔，实验重复3次。

1.2.3 实时荧光定量PCR 待200μmol/L H2O2处理4h，TRIzol裂解液收集总RNA，抽提RNA，反转录成cDNA，实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测HSPA13和抗氧化酶[超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1, GPX1)、过氧化氢酶(catalase, CAT)]的表达。各待测物引物序列如下。HSPA13 SOD1上游引物: 5′-TGTGGCCG-ATGTGTCTAT-TG-3′；下游引物: 5′-GCGTTTCC-TGTCTTTGTACTTTC-3′。GPX1上游引物: 5′-GACTACACCCAGATGAACGAG-3′；下游引物: 5′-GGACGT-ACTTGAGGGAATTCAG-3′。CAT上游引物: 5′-CAGATAGCCTTCGACCCAAG-3′；下游引物: 5′-GTAGGGACAGTTCACAGGTATATG-3′。β-actin上游引物: 5′-GAATCCCCGCCTAAGCTGA-3′；下游引物: 5′-AAGTTCGCGCTGGATAGGGCT-AC-3′。数据分析: 3次同样处理，测得的数据进行统计学分析。以β-actin作为内参基因，使用2-ΔΔCT方法进行数据分析。

1.2.4 Western印迹法检测HSPA13蛋白含量 200μmol/L H2O2处理4h，使用RIPA裂解液裂解细胞沉淀后，进行BCA定量和蛋白变性。经SDS-PAGE电泳后将蛋白转到0.45μm的PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1h，HSPA13一抗4℃孵育过夜，相应种属的二抗室温孵育1h，ECL显影采集蛋白条带图。实验重复3次，使用Image J软件进行条带分析，以β-actin作为内参，对条带的灰度值进行半定量分析。

1.2.5 免疫荧光检测HSPA13的表达 待200μmol/L H2O2处理4h，经4%多聚甲醛固定、0.1%TritonX-100透膜和3%BSA封闭步骤之后，HSPA13一抗4℃冰箱过夜，二抗室温孵育1h，DAPI染核封片，使用Nikon激光共聚焦显微镜，拍照分析HSPA13蛋白的表达。

1.2.6 质粒转染 根据LipofectamineTM3000说明书将HSPA13过表达质粒(pEGFP-N2-HSPA13)或siRNA(siHSPA13)转染到ARPE19细胞中。pEGFP-N2空载体作对照。pEGFP-N2-HSPA13上游引物: 5′-GTGATGCCCAGAGAGATGACGATC-3′；下游引物: 5′-TCAGTTGAAGTTGGTTTTTTGT-AAATG-3′。靶向GATCCCCGGCTGACGTCTTCC-ACGTC的HSPA13的小干扰RNA(siHSPA13)由拓然生物公司合成。质粒转染48h后，采用经培养液稀释的200μmol/L H2O2处理4h，进行相关的检测。

1.2.7 MDA和GSH含量测定及ROS检测 根据试剂盒说明书，采用比色法检测ARPE19细胞内MDA、GSH的含量；采用DCF法测定ROS，用激光共聚焦显微镜Nikon A1R检测细胞内的荧光强度。

1.2.8 ELISA检测促炎因子的分泌 使用200μmol/L H2O2处理过表达或干扰HSPA13的ARPE19细胞4h后，收集细胞培养上清液，分别根据TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.2.9 差异表达基因的基因本体与通路分析 将RNA测序得到的有效数据中空载组与HSPA13干扰组进行比较，对差异倍数≥1.5并且P<0.05的基因使用数据库(DAVID)进行GO富集分析和KEGG分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度H2O2处理对ARPE19细胞活力的影响

为探讨合适的H2O2处理浓度，使用不同的浓度处理细胞4h，进行细胞活力检测。CCK8法检测结果显示，随着H2O2处理浓度的上升，细胞活力降低。H2O2空白对照组及10、25、50、100、200、300、400μmol/L H2O2处理组的细胞活力分别为1.002±0.008991、0.9563±0.0427、0.9666±0.02949、0.8157±0.04948、0.7787±0.03957、0.6405±0.05403、0.4475±0.06583和0.2822±0.03536。100、200、300、400μmol/L的H2O2处理组与H2O2空白对照组相比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 氧化应激诱导ARPE19细胞中HSPA13的表达上调

为模拟氧化损伤的自然条件，本研究后续均采用差异有统计学意义的200μmol/L的H2O2处理ARPE19细胞4h建立氧化损伤模型。收集H2O2空白对照组和200μmol/L H2O2处理组的ARPE19细胞，检测HSPA13的表达变化。Western印迹法结果表明，与H2O2空白对照组相比，200μmol/L H2O2处理组HSPA13蛋白的表达上升，差异具有统计学意义(P=0.0097，P=0.0152)。另外，采用免疫荧光方法在激光共聚焦显微镜下观察HSPA13的表达与定位情况，结果见图1。

图1 HSPA13在氧化应激诱导的ARPE19细胞中表达上升Fig.1 The expression of HSPA13 was increased in oxidative stress-induced ARPE19 cells A: HSPA13蛋白的表达水平；B: 细胞免疫荧光(标尺: 50μm)；实验重复3次

2.3 CCK8法检测HSPA13的表达水平对过氧化氢诱导的细胞活力的影响

ARPE19细胞受到氧化刺激后，HSPA13的表达上调。为了明确HSPA13的表达水平对氧化应激状态下细胞活力的影响，分别过表达或干扰HSPA13，200μmol/L H2O2处理后，CCK8法检测细胞活力。CCK8法结果显示，H2O2空白对照组、200μmol/L H2O2处理组、过表达HSPA13加200μmol/L H2O2处理组和siHSPA13加200μmol/L H2O2处理组的细胞活力分别为1.145±0.0472、0.593±0.0319、0.808±0.0428、0.394±0.0492。因此，这一结果提示HSPA13的表达水平可能在ARPE19的氧化应激中发挥保护作用。

2.4 HSPA13的表达水平对ARPE19细胞内SOD1、GPX1和CAT mRNA的影响

空载体200μmol/L H2O2处理组(Vector+H2O2)的ARPE19细胞中SOD1、GPX1和CAT的mRNA的表达均显著降低，与空载体对照组(Vector)相比，差异有统计学意义(P<0.05)；与空载体200μmol/L H2O2处理组相比，过表达HSPA13加200μmol/L H2O2处理组(HSPA13+H2O2)中SOD1和GPX1的mRNA表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A～D。相反地，与单独200μmol/L H2O2处理组相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2处理组中SOD1、GPX1和CAT的mRNA表达均降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图2E～H。

图2 HSPA13的表达水平对ARPE19细胞内SOD1、GPX1和CAT mRNA的影响Fig.2 Effect of the expression level of HSPA13 on SOD1, GPX1 and CAT mRNA in ARPE19 cells A～D： HSPA13过表达；E～F： HSPA13被干扰；实验重复3次；*P<0.05；**P<0.01

2.5 HSPA13的表达水平对ARPE19细胞内MDA、GSH含量的影响

200μmol/L H2O2处理4h后，MDA的含量显著上升(P<0.05)，GSH含量显著下降(P<0.05)；与空载体200μmol/L H2O2处理组相比，HSPA13过表达加200μmol/L H2O2处理4h后，MDA含量降低(P<0.05)，GSH含量上升(P<0.05)；相反地，与200μmol/L H2O2处理组相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2处理组的MDA含量上升，GSH含量下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 HSPA13的表达水平对ARPE19细胞内MDA和GSH含量的影响Fig.3 Effect of the expression level of HSPA13 on MDA and GSH content in ARPE19 cells 实验重复3次；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.6 HSPA13的表达水平对ARPE19细胞内促炎因子分泌的影响

细胞遭受氧化损伤后可引发一系列炎症反应，其中包括促炎因子的分泌。200μmol/L H2O2处理过表达或干扰HSPA13的ARPE19细胞4h后，收集细胞培养基上清液检测TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β的含量。与空载体对照组相比，空载体200μmol/L H2O2处理组中TNF-α、IL-8、IL-2和IL-1β的含量均上升，且差异有统计学意义(P<0.05)。与空载体200μmol/L H2O2处理组相比，过表达HSPA13加200μmol/L H2O2处理组中IL-8、IL-2和IL-1β的含量下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图4A～D。相反地，与200μmol/L H2O2处理组相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2处理组中TNFα、IL-8、IL-2和IL-1β的含量均上升，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图4E～H。

图4 HSPA13的表达水平对ARPE19细胞内促炎因子分泌的影响Fig.4 Effect of the expression level of HSPA13 on the secretion of related-proinflammatory cytokines in ARPE19 cellsA～D： HSPA13过表达；E～F： HSPA13被干扰；实验重复3次；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

2.7 干扰HSPA13的表达增加氧化应激诱导的ARPE19细胞中ROS的水平

ROS常被用作判定细胞水平氧化损伤程度的指标[7]。与H2O2空白对照组相比，200μmol/L H2O2处理组的DCF荧光信号明显增强；与200μmol/L H2O2处理组相比，siHSPA13加200μmol/L H2O2处理组DCF荧光信号显著增强，见图5。结果表明，ARPE19细胞内HSPA13的水平影响氧化应激状态下细胞内ROS的产生。

2.8 基因芯片检测两组之间差异表达的基因

提取空载组和HSPA13干扰组的总RNA进行RNA测序分析，共检测到18660个基因。其中包括HSPA13基因的表达差异，差异倍数约为1.33。为了获得精准的基因GO富集分析和KEGG信号通路分析结果，只将RNA测序结果中差异倍数≥1.5且差异表达(P<0.05)的基因使用DAVID进行分析，因此HSPA13没有被筛选进入后续分析步骤。根据设定的前提条件进行筛选后发现，差异倍数≥1.5且P<0.05的差异表达的基因有318个，其中表达上调的有64个，下调的有254个，对这些差异表达的基因进行GO富集和KEGG分析。

2.9 差异基因的GO功能分析

通过GO分析，可以将差异表达的基因根据功能分为生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)3类。表达上调的基因分为细胞外空间、细胞因子活性和光刺激的感觉知觉类，表达下调的基因分为骨骼系统发展、细胞外基质、细胞黏附和肿瘤坏死因子细胞应答类，见图6。

图5 干扰HSPA13的表达增加氧化应激诱导的ARPE19细胞中ROS的水平(标尺: 50μm)Fig.5 Knockdown of HSPA13 expression increased oxidative stress-induced levels of ROS in ARPE19 cells(scale： 50μm)

图6 差异基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.10 差异基因的KEGG信号通路分析

对差异基因进行KEGG分析，结果表明共有8条信号通路与下调基因相关(均P<0.05)，见表1。下调基因的KEGG信号通路分析结果显示多条信号通路发生下调，如ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、黏着斑(focal adhesion)、TGF-β信号通路(TGF-β signaling pathway)和细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)。

表1 下调基因的KEGG相关信号通路分析

3 讨 论

AMD是发达国家老年人视力丧失的主要原因，但这种复杂疾病的发病机制尚不明确[8]。目前研究证据表明氧化应激和慢性炎症在年龄相关的RPE细胞损伤中发挥重要作用[9-10]。RPE细胞遭受长期氧化刺激导致DNA损伤，细胞结构发生变化，细胞功能被破坏[11]。细胞遭受氧化损伤可引起细胞内钙离子内流，细胞内钙离子浓度升高，导致细胞钙超载[12-13]。

HSPA13作为热休克蛋白70家族中重要的一员被克隆并明确定位于人类染色体21q11.1[14]。该基因编码一个相对分子质量为60000的蛋白，亚细胞定位于内质网，其编码的蛋白N端含有特殊前导疏水序列，这种特殊的结构导致它与其他热休克蛋白不同的是HSPA13受钙离子诱导，对热刺激无反应[15]。在鳞状头颈癌中，在肿瘤细胞中高表达的蛋白BAK1、HSPA13和CCND1表达降低在很大程度上可以抑制肿瘤的发生[16]。此外，HSPA13还与神经退行性疾病如阿尔兹海默症、癫痫等有关[17-18]。日本科学家发现HSPA13在体外过表达通过调节细胞死亡通路来增强细胞的存活率[19]。目前，HSPA13在AMD中的作用尚未有相关报道。因此，根据HSPA13的特殊性，本研究推测HSPA13可能参与了钙离子介导的RPE细胞的氧化应激过程。HSPA13是细胞内钙离子依赖性蛋白，RPE细胞氧化应激状态下，细胞钙超载，可上调HSPA13的表达。

本研究结果表明，200μmol/L H2O2处理4h引起ARPE19细胞中HSPA13的表达上升。发现在ARPE19细胞中过表达HSPA13能够减弱H2O2诱导的促炎因子的释放并上调抗氧化酶的表达，提高GSH的细胞内含量，保护细胞活力，提示HSPA13可能在AMD的发生发展中有一定的作用。与预期一致，HSPA13被干扰后转染ARPE19细胞，ROS产生增加，加剧了RPE细胞的氧化损伤。

为了更全面了解HSPA13在ARPE19氧化应激中的作用机制，本研究收集空载体组和HSPA13被干扰组的ARPE19细胞进行RNA测序分析，结果显示有318个基因有显著的表达差异。KEGG信号通路分析发现，与空载组相比，HSPA13被干扰组有8条信号通路参与其中。其中包括PI3K-Akt通路、细胞因子相关受体通路、TGFβ信号通路、ECM受体相互作用等。PI3K-Akt信号通路参与多种细胞生存与代谢过程[20-21]。有研究表明，PI3K-Akt通路在氧化应激中发挥重要作用，在AMD体外氧化应激模型中，Akt磷酸化的增强可以保护RPE细胞免受氧化损伤触发的细胞凋亡和坏死[22]。

KEGG分析表明，HSPA13干扰组中ECM受体相互作用下调。ECM参与细胞的分裂、增殖、代谢以及凋亡等多种细胞生命活动，为细胞存活和代谢的正常进行提供稳定的内环境[23]。之前研究证实，ECM的异常与AMD的形成有关[24-25]。GO分析发现，ECM相关信号通路的基因LAMA4、COL4A1、BMPER、TENM2、COL1A1、MAMDC2、ITGB3、ZNF469和THBS1的表达均降低，这提示HSPA13影响RPE细胞的ECM，参与氧化应激过程中ECM的调节。另外，KEGG分析还可以发现，HSPA13干扰组中细胞因子-细胞因子受体相互作用通路下调，该通路在AMD模型的炎症反应研究中发挥重要作用[26]。因此，对于RNA测序信号通路结果的进一步验证是后续的研究方向。

综上所述，外源性H2O2可以诱导ARPE19细胞中钙应激蛋白HSPA13的表达上升，过表达HSPA13能够减少促炎因子的释放，提高抗氧化酶的表达和细胞内GSH水平，提示HSPA13对ARPE19细胞氧化应激的保护作用。本研究从分子水平解析AMD的发病机制，为寻找AMD新的治疗靶点提供有益的线索。