叶面喷施丙三醇对烟叶碳氮代谢及硝酸盐积累的影响

冯雨晴，李亚飞，史宏志

河南农业大学烟草学院/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，郑州市金水区文化路95号 450002

白肋烟是一种典型的叶色黄绿突变的烟草类型，其烟叶色素和碳水化合物含量较低，氮同化能力弱，易导致烟叶硝酸盐含量大量积累，出现氮素利用率低的问题[1-2]。研究表明，相同施氮水平和相同生物量积累条件下，白肋烟烟叶硝酸盐含量较烤烟高百倍，进而导致烟叶中TSNAs含量较烤烟高几十甚至几百倍，与白肋烟施氮量高、碳代谢水平低和氮素同化能力弱密切相关[3-4]。因此，提高烟叶碳氮代谢水平，从而提高烟叶氮素利用效率和减少施氮量已成为减少硝酸盐积累量的一条重要途径，进而为降低烟叶中TSNAs含量奠定基础。

碳代谢与氮代谢密切相关，氮代谢需要依赖碳代谢提供能量和碳源，碳代谢又需要氮代谢提供酶蛋白和光合色素，且二者需要共同的碳骨架，还原力和ATP[5-6]。前期研究表明，白肋烟烟叶色素含量低、总糖和还原糖形成较少，为氮代谢活动提供碳骨架和能源物质不足，可能是白肋烟硝酸盐积累的根本原因[7]。

通过追加额外碳源来促进光合作用，增加光合产物的累积，从而促进植物体内氮代谢过程，有利于实现降低烟叶硝酸盐含量和增加植物产量的效果，这一研究思路已在茄子、韭菜和其他蔬菜作物中应用，且效果显著[8-9]。适宜浓度的5-硝基愈创木酚钠[10]、亚硫酸氢钠和硫酸钠[11]、硝普钠[12]、硫磺和水杨酸[13]均能直接影响蔬菜叶片氮关键酶活性，促进氮素还原同化进程，从而促进C-N转运，降低硝酸盐含量。上述物质均是通过直接影响氮代谢过程从而影响硝酸盐含量，而丙三醇降低叶片硝酸盐的积累机理有所不同。

丙三醇，又称甘油、洋密，是一种无色、无臭、甜味的黏稠状液体，因其含三个醇羟基，故极易溶于水，可随水被植物吸收[14-15]。据报道，丙三醇有2000多种用途[16]，广泛应用于食品业（包括饮料）、医药业和化妆品等行业。丙三醇属于三碳碳源，不仅为细胞生长和代谢活动提供碳骨架，而且在细胞渗透调节、光合作用、蔗糖代谢及抗逆性中均能发挥重要作用[17-18]。在研究萌发的种子代谢中发现，丙三醇能通过糖异生作用合成糖类化合物，为种子萌发一系列代谢活动提供能量和能源物质[19-20]。在叶菜类蔬菜上，喷施1.0%丙三醇后，植株叶片色素含量升高，光合作用增强，硝酸盐含量显著性下降[9,21]，但有关其效应及影响机理尚不明确。目前，关于降低白肋烟烟叶硝酸盐的调控措施多集中在调制和贮藏过程中，针对新鲜烟叶的调控措施涉及不多，有关施用丙三醇降低硝酸盐的研究中也未见其作用过程和作用机理的报道。本试验以苗期白肋烟品种TN90和TN86为材料，通过设置不同丙三醇浓度试验，确定其降低烟叶硝酸盐含量的最佳适宜浓度，并研究其在低氮和高氮水平下对烟苗色素含量、碳氮代谢关键酶活性和碳氮化合物含量的影响，为阐明丙三醇降低硝酸盐积累机理，建立有效的烟叶硝酸盐累积减控措施和降低烟叶TSNAs含量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 烟草材料和培育条件

试验在河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地气候室进行。气候室条件设置：温度为22℃～28℃，每12 h昼夜交叉光照（白天时间段设置为Am 7：00-Pm19：00），光照 800 μmol m-2s-1，湿度 85%。选用白肋烟品种TN90和TN86。烟草种子在2%次氯酸钠中消毒2次，每次5 min，随后将其播种在填满基质的200孔育苗盘中。待烟苗长至4～5烟叶（苗龄40 d左右）时，选取长势均匀一致的壮苗，移栽到填满基质的小花盆中，1株/盆。营养液配置按照霍格兰法配置，NO3-N：NH4-N = 3：1。

1.2 试验设计

1.2.1 不同丙三醇浓度筛选试验

移栽后10 d，选取长势均匀一致的烟株，开展不同丙三醇浓度筛选试验。结合前期不同丙三醇浓度预试验结果，试验设置0.025%，0.05%，0.075%，0.10%，0.15%和0.20%丙三醇浓度，TN86和TN90两个品种各进行7个浓度处理，每个处理选取5株烟，3次重复。于上午9点进行喷施不同浓度丙三醇溶液，叶片正反面均匀喷施，至叶片上的溶液形成均匀的液滴为止，对照采用同等量的蒸馏水。在喷施后7 d，分别对两个品种不同处理烟叶NO3-N含量进行测定，以筛选出降低烟叶硝酸盐含量的最佳浓度。

1.2.2 减氮条件下施用丙三醇对烟叶碳氮代谢的调控作用

在确定丙三醇最佳适用浓度后，开始进行减氮条件下施用丙三醇调控试验。以TN90作为试验材料，移栽时，选取长势均匀一致的烟苗，进行饥饿处理1 d，然后供给不同氮水平营养（24 mM和14 mM）进行培养，一周后，再进行喷施丙三醇处理，喷施浓度为丙三醇最佳适用浓度0.1%，喷施方式同上，每个处理选取6株烟，3次重复。喷施3 d、5 d、7 d、10 d、15 d后进行取样。将各处理烟苗平均分成 3 份，分别用于新鲜样本检测、新鲜样本保存（超低温冰箱-80℃中保存）和杀青样本保存。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 生物量积累测定

选取处理后长势一致的烟株，将其根、茎和叶片在烘箱中105℃杀青20 min，60℃烘干至恒重，称重，磨碎，过60目筛子，主要用于烟株生物量积累和化学成分测定。

1.3.2 烟叶色素、可溶性蛋白质含量和氮代谢酶活性测定

选取各处理长势均匀一致的烟苗，选择最大功能叶6-8支脉之间叶肉，用剪刀将其剪成2 mm ×5 mm条状，混匀后，用于测定烟叶NR活性、GS活性、可溶性蛋白质和色素含量等。应用O΄Neal等[22]方法测定烟叶GS活性，色素含量采用95%乙醇测定，NR活性采用活体法测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[23]，具体方法均参照李合生植物生理生化实验指导说明书进行。

1.3.3 烟叶硝酸盐和常规化学成分测定

烟叶NO3-N含量采用浓H2SO4-水杨酸法测定[24]，烟叶总氮、总糖和还原糖含量按照国家烟草行业标准YC/T161，159-2002在流动分析仪上完成检测[25]。

烟叶氮素积累量和氮素利用效率计算方法：

烟叶氮素积累量（mg/株）=烟叶总氮含量（%，g/100g）×叶干重（g/株）×10

烟叶氮素利用效率（N utilization efficiency，NUE单位：mg DW/mg N） =叶片干物重/烟叶氮素积累量

1.3.4 目标基因qRT-PCR 测定

根据 GenBank 中EGY1基因（Gene ID：833476）序列、CP12-2基因（Gene ID：825214）序列、PGK基因（Gene ID：107787830）序列、PPC16基因（Gene ID：547769）序列、GLPK基因（Gene ID：109221820）序列、SPS基因（Gene ID：107766133）序列、SUS2基因（Gene ID：109214879）序列、NIA1基因（Gene ID：107823732）序列、NLP7 基因（Gene ID：828502）序列、NPF7.3基因（Gene ID：840139）序列，分别设计特异性引物，具体如表1。按反转录试剂盒说明书合成 cDNA 第一链，以 cDNA 为模板, 按SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）说明书进行 qRT-PCR。反应体系含QuantiFast® SYBR® Green PCR Master Mix（2×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μM ×）0.2 μL、PCR Reverse Primer（10 μM×）0.2 μL、Nuclease-free H2O 0.4 μL、cDNA 模板1 μL。反应程序为，95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火及延伸30 s，40 个循环，每个处理 3 次重复，每个反应 3 次重复。根据扩增曲线确定每个基因的响应 Ct 值，以 L25 为内参矫正 PCR 模板的拷贝数，采用 2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

1.4 数据分析

采用Excel和Origin pro 9.0软件进行数据分析和制图；采用SPSS 24.0软件和LSD法，对不同化学调控处理间烟叶生物量积累、色素含量、NR和GS活性、可溶性蛋白质、总氮、总糖、还原糖和NO3-N含量进行多重比较和方差齐性检验。

2 结果与分析

2.1 白肋烟苗期施用丙三醇的适宜浓度筛选

由图1可知，不同丙三醇浓度对烟叶NO3-N含量的影响不同。本试验条件下，在0.025%～0.15%浓度范围内，施用丙三醇均能降低烟叶NO3-N含量，差异达到显著或极显著水平，且以0.1%浓度的降低效果最佳；在施用丙三醇0.2%浓度时，烟叶NO3-N含量与对照差异较小，且对烟苗叶片有一定的灼伤现象，可能与丙三醇具有较强的吸湿性有关，若施用浓度过高，易引起胞内水分外泄，造成细胞严重失水和产生不可逆的伤害。由此可知，在苗期，喷施不同丙三醇浓度对降低白肋烟烟叶NO3-N含量的效果，以0.1%处理最佳。

2.2 减氮条件下施用丙三醇对生物量积累的调控作用

烟叶生物量积累数量是烟株碳氮代谢活动的综合结果，在一定程度上能够体现出烟苗素质情况。由图2可知，在低氮条件下，喷施丙三醇15 d后，烟叶和地上部分生物量积累数量分别升高了13.36%和14.75%，差异达显著或极显著水平；在高氮条件下，喷施丙三醇15 d后，烟叶和地上部分生物量积累数量分别升高了10.20%和9.97%，差异均达显著性水平。由此说明，不同施氮水平下喷施丙三醇对增加烟叶生物量积累和壮苗有积极作用。

2.3 减氮条件下施用丙三醇对烟叶色素和可溶性蛋白质含量的调控作用

由图3可知，在低氮条件下，喷施丙三醇后15 d，烟叶色素含量和可溶性蛋白质含量分别升高了14.48%和12.79%；在高氮条件下，喷施丙三醇15 d后，烟叶色素含量和可溶性蛋白质含量分别升高了45.71%和35.76%，且低氮条件下喷施丙三醇后，烟叶色素和可溶性蛋白质含量与高氮条件下对照处理相近，由此说明，减氮条件下喷施丙三醇能促进烟叶色素和蛋白质合成，对降低烟叶硝酸盐含量有利。

图2 不同氮水平下施用丙三醇对烟叶叶片和地上部分生物量积累影响Fig.2 Effect of foliar application of glycerol on biomass accumulation in leaves and above-ground parts of tobacco under different nitrogen levels

图3 不同氮水平下施用丙三醇对烟叶色素和可溶性蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of foliar application of glycerol on pigment and soluble protein content in tobacco leaves under different nitrogen levels

2.4 减氮条件下施用丙三醇对烟叶总糖和还原糖的调控作用

由图4可知，在不同施氮条件下，施用丙三醇对烟叶总糖和还原糖含量的影响不同。其中，在高氮和低氮处理中，喷施丙三醇15 d后，烟叶总糖和还原糖含量均呈现出升高趋势，且差异均达到极显著性水平。在低氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶总糖和还原糖含量分别升高了47.76%和44.57%；在高氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶总糖和还原糖含量分别升高了25.15%和32.84%，且低氮条件下喷施丙三醇后，烟叶总糖和还原糖含量高于高氮条件下空白处理，由此说明，减氮条件下喷施丙三醇能促进碳固定能力，促进碳水化合物合成，为烟叶还原同化和其他代谢过程提供充足碳源，对降低烟叶硝酸盐含量和提高烟叶产量有利。

图4 不同氮素处理烟叶总糖和还原糖含量比较Fig.4 Comparison of total sugar content and soluble reducing sugar content in tobacco leaves under different nitrogen levels

2.5 减氮条件下施用丙三醇对烟叶总氮和氮素积累量的影响

由图5可知，在不同施氮条件下，施用丙三醇对烟叶总氮和氮素积累量的影响不同。其中，在高氮和低氮处理中，喷施丙三醇15 d后，烟叶总氮含量均有下降趋势，但处理与对照相比差异未达到显著性水平，而烟叶氮素积累量呈现出升高趋势，且低氮条件下差异达到极显著性水平。在低氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶总氮含量下降了2.98%，烟叶氮素积累量升高了10.21%；在高氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶总氮含量下降了6.37%，烟叶氮素积累量升高了3.15%，一方面说明，喷施丙三醇增加烟叶生物量积累，从而使烟叶氮素积累量呈现增加趋势；另一方面表明，喷施丙三醇能促进烟株碳氮代谢，对增加生物量积累和烟苗素质有积极作用。

图5 不同氮水平下施用丙三醇对烟叶总氮和氮素积累量的影响Fig.5 Effects of foliar application of glycerol on total nitrogen content and nitrogen accumulation in tobacco leaves under different nitrogen levels

2.6 减氮条件下施用丙三醇对烟叶NO3-N含量的调控作用

由图6可知，在高氮和低氮条件下，喷施丙三醇后7 d，烟叶NO3-N含量分别下降了59.67%和53.22%。由此说明，喷施后7 d，丙三醇对烟叶NO3-N含量的降低效果最明显；烟叶NO3-N含量在达到最低值后又呈现出升高趋势，结合烟叶NR和GS活性的表现情况推测，可能是由于其在促进氮同化作用的同时也促进了氮素吸收作用。

2.7 减氮条件下施用丙三醇对烟叶氮代谢关键酶活性的调控作用

图6 不同氮水平下施用丙三醇对烟叶NO3-N含量的影响Fig.6 Effect of foliar application of glycerol on NO3-N content in tobacco leaves under different nitrogen levels

图7 不同氮水平条件施用丙三醇对烟叶NR和GS活性的影响Fig.7 Effect of foliar application of glycerol on activities of NR and GS in tobacco leaf under different nitrogen levels

由图7可知，在不同施氮条件下，喷施丙三醇对烟叶NR和GS活性的影响不同。在低氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶NR活性呈现出先升高后下降的趋势，在喷施后5 d达到最大值，而GS活性呈现出先下降后持续升高趋势；在高氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶NR活性呈现出先升高后下降再升高的趋势，即在喷施后3 d达到第一个峰值，随后出现下降趋势，在喷施后7 d达到最小值的峰值，随后又呈现出升高趋势，可能是由于硝酸还原酶是一种诱导酶，受底物NO3-含量影响发生变化，进一步解释了硝态氮的变化现象，而GS活性则呈现出先下降后持续升高趋势，由此说明喷施丙三醇能迅速提高烟叶NR活性，对GS活性的促进作用较对NR活性作用滞后，对促进氮同化作用和硝酸盐含量有利。

2.8 减氮条件下施用丙三醇对烟叶氮素利用效率的影响

氮素利用效率反映植株地上部吸收利用氮肥的能力，其大小与叶片硝酸盐含量密切相关。由图8可知，在不同施氮水平下，喷施丙三醇均能提高叶片氮素利用效率。其中，在高氮条件下，喷施丙三醇15 d后，烟叶氮素利用效率提高了6.81%，差异达显著水平，且烟叶氮素利用效率在低氮水平喷施丙三醇条件下高于高氮水平不喷施丙三醇，与丙三醇促进生物量积累，增加氮素同化利用能力有关。

2.9 不同处理烟叶碳氮代谢途径关键基因表达分析

图8 不同氮水平下施用丙三醇对氮素利用效率的影响Fig.8 Effect of foliar application of glycerol on nitrogen utilization efficiency in tobacco leaves under different nitrogen levels

高氮条件下喷施丙三醇2 d后，对白肋烟烟叶碳氮代谢途径关键基因表达进行分析，结果（图9）显示，喷施丙三醇后，参与光反应的基因EGY1和CP12-2，碳固定途径基因PGK、PPC16和GLPK，蔗糖合成基因SPS和SUS2-2以及硝酸盐转运和还原同化基因表达量均显著上调。与对照相比，基因CP12-2、PPC16和NPF7.3的表达量增加0.5倍多，表明丙三醇能增强白肋烟烟叶光合作用、碳固定和硝酸盐转运同化能力，促进碳水化合物的合成和降低烟叶硝酸盐积累量。

图9 高氮条件下丙三醇处理烟叶碳氮代谢关键基因表达情况Fig.9 Expression of key genes in carbon and nitrogen metabolism pathway in tobacco leaves with foliar application of glycerol under high nitrogen level

3 讨论

前期研究表明，白肋烟烟叶NR和GS活性相对较低，氮同化能力弱，是引起烟叶硝酸盐大量积累的重要原因；色素含量低、总糖和还原糖形成较少，为氮代谢活动提供碳骨架和能源物质不足，可能是白肋烟硝酸盐积累的根本原因[7]。丙三醇属于一种三碳碳源，具有良好的水溶性，能够在光合作用不足的情况下提供碳源，对降低植株硝酸盐含量具有突出的效果[26]。前期试验中，我们通过施用不同外源物质调控白肋烟烟叶氮代谢中发现，喷施丙三醇能降低烟叶硝酸盐含量，且效果显著。徐广辉等[9]研究发现，1.0%的丙三醇可显著降低韭菜硝酸盐含量，提高韭菜产量。本试验条件下，在0.025%～0.15%浓度范围内，喷施丙三醇后均能明显降低烟叶硝酸盐含量，且以0.1%浓度处理效果最佳，韭菜和白肋烟所需浓度不同，可能与作物种类有关；喷施丙三醇后，烟叶色素和蛋白质含量有明显的升高趋势，与徐广辉[9]和庞强强等[23]的研究结果较为一致。徐光辉[27]的研究也表明，丙三醇可降低茄子和小白菜硝酸盐含量，且可溶性糖含量和品质显著提高。本次试验研究中，在高氮和低氮水平下，喷施丙三醇15 d后，烟叶生物量、总糖和还原糖含量显著升高；同时在低氮条件和高氮条件下，喷施丙三醇后，烟叶NR活性迅速升高，GS活性呈现出持续升高趋势，可能是由于喷施丙三醇后，烟叶色素含量增加，碳固定能力增强，总糖和还原糖等能源物质增加，有助于氮还原同化作用增强。在本试验中，不同施氮水平下喷施丙三醇后，烟叶氮素积累量和蛋白质含量呈现升高趋势，但烟叶总氮和硝态氮含量降低，其中，不同施氮水平下喷施丙三醇7 d后，烟叶硝酸盐含量显著下降，说明丙三醇可以促进白肋烟氮素还原同化能力，有利于实现促进烟叶硝酸盐还原同时又能促进氮素同化，对降低烟叶硝酸盐有正面作用。

硝酸盐一旦储藏便很难被利用[28]，白肋烟硝酸盐运输能力低于其他类型烟草[7]，NPF3.1和NPF7.3是低亲和力质子依赖的双向硝酸盐转运子，调控亚硝酸盐进入叶绿体和硝酸盐进入木质部的过程[29]。NLP7是参与初级NO3-响应的一个重要转录因子，能过对氮代谢过程中一些关键基因（NRT2.1、NITR2:1、NIA1、NIR1）进行调节，在硝酸盐响应过程中起到正向调节的作用[30]。本试验中进一步基因表达分析结果表面，喷施丙三醇使烟叶白肋烟烟叶NPF7.3、NIA1等硝酸盐转运、还原和NLP7基因表达量显著上调，且NRA、GSA和氮同化产物（可溶性蛋白质含量）提高，硝酸盐含量降低。由此说明，丙三醇调控烟叶氮素转运、还原和同化过程，从而影响烟叶硝酸盐含量。

光既是一种能量来源又是一种刺激信号，参与调控植物体内许多代谢过程[31]。且光通过在光合系统 II和光合系统 I 中一系列的能量转化及电子传递，可参与调控碳固定和氮还原过程[32]。喷施丙三醇后，响应光刺激相关基因EGY1和CP12-2，碳固定和糖类物质合成相关基因CP12-2、EGY1、PGK、PPC16、GLPK、SPS和SUS2-2表达水平显著上调，与生物量积累和碳水化合物含量变化趋势一致。与对照相比，基因CP12-2、PPC16和NPF7.3的表达量增加0.5倍多，表明喷施丙三醇可以使烟叶保持较强的碳氮代谢水平，能够实现降低烟叶硝酸盐含量的目的。近些年来，国内外学者研究表明，烟叶硝态氮含量与施氮量呈正相关，氮肥用量过大是造成作物NO3-积累过多的直接原因之一[33-34]，因此通过减氮配合喷施丙三醇能够在获得相同生物量的情况下达到降低烟叶硝酸盐含量的目的，进而实现烟叶减肥增效和减害，有待于进一步研究和在大田条件下验证。

4 结论

不同施氮水平下喷施丙三醇能显著提高白肋烟烟叶生物量、色素、蛋白质、氮素积累量、氮素利用效率和碳水化合物含量，而总氮和硝酸盐含量呈现下降趋势。基因表达分析结果表明，喷施丙三醇后，白肋烟烟叶碳固定相关基因EGY1、CP12-2、PGK、PPC16和GLPK，糖类物质合成相关基因SPS和SUS2-2，硝酸盐转运和还原同化相关基因NPF7.3、NIA1和NLP7表达水平显著上调。丙三醇通过调控烟叶碳固定和氮素转运、还原同化能力，影响烟叶碳氮代谢，促使白肋烟烟叶碳水化合物含量增加和硝酸盐积累量减少。