眼络通对兔视网膜静脉阻塞相关生长因子表达的影响*

冯燕兵 熊 烈 曾子善 沈志新 朱洁云 徐 蕴 石彦波 翁文庆#

1浙江省嘉兴市中医医院 浙江 嘉兴314000 2浙江中医药大学 浙江 杭州310051 3江苏省启东市人民医院 江苏 启东226200

视网膜静脉阻塞（RVO）是一种常见的危害视功能的视网膜血管疾病。本研究旨在探讨眼络通方对RVO新西兰兔视网膜组织血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）mRNA表达的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组：清洁级健康实验新西兰兔66只，体重1.5～2.0kg，雄性，眼检查无异常，购自嘉兴学院动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK（浙）2013-0056。将动物随机分为6组：空白对照组6只，模型对照组、天保宁组、眼络通低、中、高剂量组各12只。

1.2 实验药物及仪器：眼络通颗粒方（葛根20g，川芎、地龙、三棱各10g，水蛭3g），由嘉兴市中医医院药剂科提供；天保宁（博普-益普生工业公司，批号：H2003122）；20%乌拉坦（嘉兴学院提供）；逆转录试剂盒（Invitrogen，18080-051）；SYBR Green 荧光定量试剂盒（Thermo Fisher，A25742）；ABI 7500荧光定量PCR仪。

1.3 RVO 家兔模型的建立：健康新西兰兔充分扩瞳，20%乌拉坦全身麻醉，拍摄无赤光眼底像，氩离子激光封闭兔视乳头两侧髓翼血管系之主干静脉（光凝斑直径200～250μm，功率600～800mW，时间0.3～0.5s）。造模完成24h后作眼底血管造影检查，验证是否成功。

1.4 动物实验给药方法：术后24h 开始灌胃给药，1次/天，连续给药4周，参照体重剂量换算方法计算给药量；空白对照组及模型对照组给予5ml/kg生理盐水；天保宁组给药剂量0.02g/kg；眼络通低、中、高剂量组分别给药剂量2.3g/kg、4.6g/kg、6.9g/kg。

1.5 取材及样本保存：造模后连续灌胃给药干预，分别在干预后的第1、2、4周，空气处死，每次空白组2只，余组每组4只。及时摘除眼球，制成眼杯，分离取出视网膜组织，于液氮中快速冷冻后转至-80℃冰箱保存。

1.6 RT-PCR 检测VEGF、PDGF、PEDF mRNA 的表达：将总RNA逆转录为cDNA，为模板β-actin为内参进行荧光定量PCR 实验，特异性引物序列见表1，荧光定量PCR 反应条件见表2。采用△△Ct 法计算各基因mRNA 的表达情况，倍增变化率=2-△△Ct（△△Ct=实验组△Ct-空白对照组△Ct，△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct）。

表1 特异性引物序列

表2 荧光定量PCR反应条件

1.7 统计学方法：使用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，组间比较使用方差分析，两两比较使用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

VEGF 与PDGF 基因mRNA 表达量各组趋势相似，见图1。模型对照组在造模1、2、4周后，VEGF 与PDGF 基因mRNA表达量显著高于空白对照组同期（均P＜0.05），且在第2周时表达量最高；VEGF 分别上调约860%、1530%、980%，PDGF 分别上调约830%、2690%、1040%。天保宁组较模型对照组除第4周VEGF 基因mRNA 表达量下调约20%外（P＜0.05），其余各点两者表达量无显著差异（均P＞0.05）。眼络通各剂量组同一时间点随给药浓度的上升VEGF 与PDGF 基因mRNA 表达量逐渐下降，且眼络通高剂量组的第2周高峰均消失。眼络通高剂量组第1、2、4周VEGF 基因mRNA 表达量较模型对照组分别下调约60%、80%、70%（均P＜0.05）；PDGF 分别下调约60%、80%、60%（均P＜0.05），但二者各时间点表达量仍均显著高于空白对照组（均P＜0.05）。

图1 眼络通方对RVO家兔视网膜VEGF（左）和PDGF（右）表达的影响

PEDF 基因mRNA 表达量呈相反趋势，见图2。模型对照组在造模1、2、4周后，PEDFmRNA 表达量分别下调约40%、30%、50%（均P＜0.05）。天保宁组较模型对照组分别上调约160%、180%、250%（均P＜0.05）。眼络通各剂量组同一时间点随给药浓度上升，PEDFmRNA 表达量逐渐上升，且眼络通高剂量组在第2周时出现高峰。眼络通高剂量组各时间点PEDFmRNA 表达量较模型对照组分别上调约430%、780%、540%（均P＜0.05），且较空白对照组分别上调约190%、280%、190%（均P＜0.05）。

图2 眼络通方对RVO家兔视网膜PEDF表达的影响

3 讨论

视网膜静脉阻塞（RVO）属于中医学中“暴盲”范畴，病因、病机复杂多样，其客观结果皆为瘀血形成，以活血化瘀法为基本治法，眼络通由葛根、川芎、地龙、三棱、水蛭五味中药组成，全方共奏活血化瘀、破血消积之效[1]。

目前认为，VEGF、PDGF、PEDF在RVO新生血管形成中发挥重要作用。VEGF 是促进血管新生最重要的诱导因子；同为血管生成因子的PDGF 不仅能单独促进新生血管生成，同时对VEGF 有促进作用，能显著上调VEGF 表达[2]。PEDF 对VEGF、PDGF 表达也起到拮抗作用，抑制新生血管生成[3]。本研究发现，VEGF与PDGF基因mRNA相对表达量在模型对照组1周、2周、4周3个时相中表达皆高于空白对照组，这与既往研究中发现RVO 发生后，眼内VEGF 有较高表达这一结果相符[4]；与PDGF 在脉络膜新生血管模型中呈现高表达[2]及BRVO 患者的房水中表达显著增高[5]这一研究结果相符。对于各用药组而言，天保宁组对RVO 新西兰兔视网膜VEGF 与PDGF 基因表达影响较小，基本与模型对照组无差异；而眼络通各剂量组随着给药浓度的上升，VEGF 与PDGF 基因表达量逐渐降低，且以眼络通高剂量组表达量最低。值得注意的是，模型对照组中VEGF、PDGF 基因在第2周时表达量最高，我们猜测这可能与造模前新西兰兔健康状况良好，视网膜及血管自我修复能力强，造模后视网膜侧支循环形成速度快有关。有研究表明，在鼠视网膜新生血管模型中PEDF 表达明显下降[3]，本研究得到了相似的结果：模型对照组各时相PEDF 基因mRNA 表达低于空白对照组。眼络通各剂量组PEDF 各时相表达量与VEGF、PDGF 呈负相关，且以眼络通高剂量组上调最为明显。

综上所述，笔者发现在RVO 新西兰兔视网膜组织中VEGF 与PDGF 基因的表达与眼络通给药剂量呈负相关，与PEDF 呈正相关。说明，上述3种因子可能是眼络通治疗RVO的作用靶点。本实验为眼络通方的临床应用提供了有力的支撑。