应用一致性检验对泌尿系结核3种检测方法的评估

张昭勇，杨宏伟，张吉才

(十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院检验部，湖北十堰 442000)

结核是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，目前仍然是全球最关注的公共卫生问题。2018年WHO发布的报告显示，在世界范围内，结核病是十大死因之一，也是传染病中全球第一大死因,且大多数病例发生在亚洲和非洲。2017年，结核病共造成了约130万艾滋病毒阴性人群和30万艾滋病毒阳性人群死亡[1]。在2017年新诊断的640万例结核病中肺外结核(EPTB)新发或复发占14%。一系列数据显示EPTB在很多地方都有增加的趋势，但是公共卫生部门并未给予高度重视，这主要是因为EPTB与结核的传播并不显著相关。然而，EPTB在结核病的病死率、严重并发症和致残率较高，是迫切需要解决的一个问题[2-3]。

泌尿系结核是EPTB较为常见的一个类型，也是临床上一种严重的EPTB，临床上5%～20%的肺结核伴有泌尿系结核[4-5]。泌尿系结核极易误诊，原因在于其症状类似于普通的细菌感染且缺乏快速灵敏的实验室诊断方法，导致患者延误治疗而预后不良。目前，实验室诊断泌尿系结核的方法主要包括抗酸染色和分枝杆菌培养。抗酸染色既便宜又快速，但缺乏灵敏度和重复性。结核的固体和液体培养虽然具有较高的灵敏度和特异度，但是耗时、耗力，不能满足快速的临床要求[6-7]。随着分子生物学技术的突飞猛进，耐药结核病相关耐药基因快速诊断技术的使用日益广泛。结核分枝杆菌rpob基因和突变检测技术(Xpert MTB/RIF)系统就是一种全新的快速检测结核分枝杆菌和其耐药性的系统，该系统针对结核分枝杆菌的81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)设定引物、探针并进行扩增检测，根据其是否发生基因突变来检测样本中是否含有结核分枝杆菌及其是否对利福平耐药。该系统是一种全自动一体化半定量巢式实时PCR系统， 可以在2 h内快速对样本进行核酸提取、纯化及浓缩检测，有报道称其在肺结核诊断的灵敏度和特异度可高达77.2%和98.8%[8]。但是，GeneXpert尿样本检测诊断泌尿系结核的数据有限，其诊断效率需要进一步评估。为对上述泌尿系结核诊断的实验室方法进行合理评估，笔者对临床收集的163例疑似泌尿系结核的住院患者尿标本同时进行盲法检测，以临床综合诊断作为泌尿系结核诊断的“金标准”，对抗酸染色镜检法、结核杆菌固体培养和Xpert MTB/RIF检测法进行诊断性能评价，分析它们的诊断价值并比较其一致性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年3月至2018年6月本院住院疑似泌尿系结核患者163例，其中男89例，女74例；年龄29～83岁，平均(57.89±12.98)岁。

1.2仪器与试剂 美国赛沛GeneXpert Dx System及Xpert MTB/RIF 试剂盒，光学显微镜(日本Olympus)、抗酸染液(珠海贝索生物技术有限公司)、载玻片、香柏油、CO2孵育箱、罗氏培养基(珠海贝索生物技术有限公司)。

1.3检测方法

1.3.1尿标本Xpert MTB/RIF检测 患者无菌留取晨尿40 mL,实验操作严格按照Xpert MTB/RIF 试剂盒说明书进行,即取2 mL尿标本加入4 mL样本处理液，震荡混匀后室温孵育15 min，取2 mL上清液加入检测试剂盒并加载到GeneXpert Dx System。仪器在大约2 h内自动完成对结核分枝杆菌和RIF耐药基因的检测。

1.3.2结核分枝杆菌固体培养 取20 mL尿标本，经3 000×g离心20 min，取沉渣加等量4%NaOH消化液，处理15～20 min后用PBS缓冲液中和(pH=7.4)，取0.1 mL接种罗氏固体培养基,CO2孵育箱35 ℃，8周未见菌落生长者可报告阴性。

1.3.3抗酸染色 取10 mL尿标本，经3 000×g离心20 min，取沉渣涂片干燥抗酸染色，操作步骤按照抗酸染液(珠海贝索生物技术有限公司)说明书进行。镜检连续观察300个油镜视野，结果按照全国临床检验操作规程报告。

1.3.4泌尿系结核临床诊断 “金标准” 包括患者临床症状、实验室检查及放射影像学特征。无阳性培养证据的可疑患者抗结核治疗有效是确诊泌尿系结核的唯一指标[9]。

1.4统计学处理 使用SPSS18.0软件进行数据处理，计数资料以率表示，率的比较采用χ2检验。Kappa一致性检验评价不同检测方法的一致性，当Kappa值<0.00，一致性强度极差；0.00～0.20，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，高度；0.81～1.00，极强。Kappa值的假设检验，μ>1.96,P<0.05可认为2种测定方法结果具有一致性[10]。样本含量的估算：估计该试验灵敏度为85%，特异度为80%，设允许误差Δ=0.10，α=0.05，Zα=1.96(双侧)。则病例组样本量=1.962×0.90×(1-0.90)/0.102=49；对照组样本量=1.962×0.80×(1-0.80)/0.102=92，研究样本多于最少估计例数，具有研究意义。

2 结 果

2.13种方法诊断泌尿系结核的检测结果及一致性比较 163例疑似泌尿系结核患者中CT或X线片阳性患者46例。163例标本以泌尿系结核临床诊断为“金标准”检出泌尿系结核52例(31.90%)，Xpert MTB/RIF、结核杆菌固体培养与抗酸染色的检出率分别为31.29%(51/163)、24.54%(40/163)和23.93%(39/163)，其检出率比较差异有统计学意义(P<0.05)。3种实验室检测方法与泌尿系结核临床诊断比较，Xpert MTB/RIF法和结核杆菌固体培养具有极强的一致性，涂片抗酸染色的一致性较弱，结果见表1。

2.23种诊断性试验的诊断效能评价 3种诊断试验中，结核杆菌固体培养的特异度最高，Xpert MTB/RIF灵敏度最高，而涂片抗酸染色的灵敏度和特异度均不佳。见表2。

表1 3种方法诊断泌尿系结核的检测结果

表2 3种诊断性试验的诊断效能评价(n)

3 讨 论

泌尿系结核是EPTB最常见的一个类型，由于该类患者缺乏特异性临床症状，其诊断是医学上的一大难题。目前泌尿系结核的实验室诊断方法包括抗酸或荧光染色镜检、固体或液体培养。镜检方法廉价快速，但是灵敏度低，对人员素质要求高，容易导致漏诊；培养方法特异度强，但是通常需要6～8周才能获得结果，无法满足临床快速早期诊断的需求。鉴于传统诊断方法的固有缺点，急需一种快速、灵敏、特异度高的新型诊断方法。Xpert MTB/RIF检测技术是WHO在2010年12月推荐用于肺结核诊断的一种新技术，在痰或灌洗液标本的检测中表现出优异的特性[11]，但是其在泌尿系结核诊断中的价值尚缺乏研究数据。本研究应用一致性检验评估抗酸染色镜检、结核杆菌固体培养和Xpert MTB/RIF分析法在泌尿系结核诊断中的价值。

本研究以临床综合诊断作为泌尿系结核诊断的“金标准”，评估3种诊断试验的性能，结果显示，Xpert MTB/RIF法(Kappa值=0.815)和结核杆菌固体培养法(Kappa值=0.819)与临床诊断具有极强的一致性，而抗酸染色镜检(Kappa值=0.319)的一致性较弱。3种方法的检出率比较差异有统计学意义(χ2=43.09，P<0.05)，Xpert MTB/RIF法(31.29%)检出率明显高于抗酸染色镜检(23.93%)和结核杆菌固体培养法(24.54%)，但与临床诊断的“金标准”检出率(31.90%)基本一致。研究数据表明在检测尿样中的结核分支杆菌上，Xpert MTB/RIF的性能优于涂片抗酸染色和结核杆菌固体培养法。上述方法灵敏度的差异主要取决于它们的检测极限。在这3种方法中，涂片抗酸染色需要5×103～1×104CFU/mL才能产生阳性结果，而Xpert MTB/RIF试验的检测极限报告为131 CFU/mL[12-13]。结核分枝杆菌固体培养检测极限有报道称为10～100 CFU/mL，但在本研究中其灵敏度低于Xpert MTB/RIF。其原因可能是Xpert MTB/RIF通过检测死亡细菌细胞中的残留DNA而得到增强，而培养中标本不能及时处理和使用4%NaOH消化液消化可能导致部分活菌死亡并导致培养的灵敏度下降。涂片抗酸染色检测极限差，需要较高的细菌浓度才能检测出阳性。另外一个导致尿涂片抗酸染色灵敏度较差的原因是尿液的非黏性性质降低标本中抗酸杆菌在玻片的稳固性，从而降低尿样中涂片的阳性率[14]。涂片抗酸染色特异度较低主要由于非典型分支杆菌的存在导致“假阳性”结果和染色不佳时抗酸颗粒影响阅片。尽管有这些缺点，涂片抗酸染色对于EPTB，特别是在结核病高负担地区仍然是一种廉价、快速有效益的筛查方法。

3种结核分支杆菌诊断方法在泌尿系结核诊断中结核杆菌固体培养法特异度最强，是泌尿系结核确诊的一个重要依据，并且可以为治疗提供药物灵敏度试验，但是培养时间长限制了其广泛应用。尿沉渣抗酸染色镜检价格低廉，实验室要求低，适合结核高发区泌尿系结核的快速筛查。由于其灵敏度和特异度均较差，需要多次重复检查。对于尿液非黏性特性提示需要改进技术，如在沉渣中加入无菌血清，从而提高结核分支杆菌的黏附性，以提高镜检的阳性率。Xpert MTB/RIF 检测技术不但具有较高的灵敏度，而且具有很高的特异度，可在2 h内快速对尿液样本中的结核分支杆菌进行检测，是一种快速高效的诊断泌尿系结核的方法，但是昂贵的费用对于发展中国家的患者是一种沉重的负担[15]。Xpert MTB/RIF技术在尿液标本结核分支杆菌检测的灵敏度低于痰标本，其原因与泌尿系结核患者排菌量较低并且呈间断性有关，提示可以通过留取更多标本进行集菌后检测来提高其灵敏度。

4 结 论

3种实验室检测方法与临床诊断“金标准”法比较，经Kappa检验，Xpert MTB/RIF和固体培养法具有很高的一致性。研究数据表明GeneXpert在检测性能上优于涂片抗酸染色和结核杆菌固体培养，该方法可以为临床早期、快速诊断泌尿系结核提供实验室依据。