基于TGF-β1/p38MAPK通路探讨益血降浊汤对UUO大鼠肾纤维化的作用机制

杨少宁 周锦纹 陈丹倩 陈淋 毛加荣 于小勇

摘要：目的探討益血降浊汤对单侧输尿管结扎（UUO）大鼠肾纤维化的作用及TGF-β1/p38MAPK通路相关蛋白的影响，阐明其作用可能的机制。方法建立UUO大鼠模型，将42只大鼠随机平均分为假手术组、UUO组、UUO+依那普利组、UUO+益血降浊汤低、中和高剂量组。于2周后处死，记录尿量、体重数据，采集血液检测氧化应激相关指标MDA、ROS和SOD含量。并取肾组织，Masson染色观察肾组织病理改变;免疫组织化学染色检测COX-2、Collagen I和p-p38MAPK表达情况;蛋白免疫印迹检测炎症、细胞外基质（ECM）以及TGFβ1/p38MAPK通路相关蛋白的表达。结果与UUO组相比，益血降浊汤（低、中、高）均能逆转大鼠尿量和体重的下降;降低ROS和MDA的水平，促进SOD的增加;减轻肾组织病理改变;下调炎症相关蛋白的表达，使抗炎因子的表达增加;减少ECM的沉积;抑制TGF-β1/P38MAPK通路活性;其中，高剂量组效果最为显著。结论益血降浊汤可能通过调控TGF-β1/p38MAPK通路活性改善炎症和氧化应激、抑制肾纤维化来发挥肾保护作用。

关键词：益血降浊汤;炎症;氧化应激;细胞外基质;TGF-β1/p38MAPK通路;肾纤维化

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2019）10-0060-08

Study on the Mechanism of Yixue Jiangzhuo Decoction on Renal Fibrosis

in UUO Rats Based on TGF-β1/p38MAPK Pathway

YANG Shao-ning1，ZHOU Jin-wen1，CHEN Dan-qian2，CHEN Lin2，MAO Jia-rong1，YU Xiao-yong1

（1. Department of Nephrology，Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xian 710003，China;

2. College of Life Science，Northwest University，Xian 710069，China）

【Abstract】Objective： To study the effects of Yixue Jiangzhuo Decoction on renal fibrosis in rats with unilateral ureteral obstruction（UUO）and the related proteins of TGF-β1/p38MAPK pathway，and to elucidate its possible mechanism. Methods： A UUO rat model was established. 42 rats were randomly divided into sham operation group，UUO group，UUO+enalapril group，and low，medium and high dose groups of UUO+Yixue Jiangzhuo Decoction. After 2 weeks，the rats were sacrificed，and their urine volume and body weight data were recorded and their blood was taken to detect the content of related indicators MDA，ROS and SOD for oxidative stress. Their renal tissue was taken to observe the pathological changes of renal tissues by Masson staining. The expressions of COX-2，Collagen I and p-p38MAPK were detected by immunohistochemical staining. Inflammation，extracellular matrix（ECM）and TGFβ1/p38MAPK pathway-related proteins were detected by western blotting. Results： Compared with the UUO group，Yixue Jiangzhuo Decoction（low，medium and high doses）can reverse the decrease of urine volume and body weight in rats，reduce the levels of ROS and MDA，promote the increase of SOD and relieve the pathological changes of renal tissues. It also down-regulated the expression of inflammation-related proteins，increased the expression of anti-inflammatory factors，decreased the deposition of ECM and inhibited the activity of TGF-β1/P38MAPK pathway. Among them，the high-dose group was the most effective. Conclusion： Yixue Jiangzhuo Decoction may play a role in renal protection by regulating the activity of TGF-β1/p38MAPK pathway to improve inflammation and oxidative stress and inhibit renal fibrosis.

【Key words】Yixue Jiangzhuo Decoction，inflammation，oxidative stress，extracellular matrix，TGF-β1/p38MAPK pathway，renal fibrosis

肾小管间质纤维化被认为是所有慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发展为肾功能衰竭的共同途径。其病理演变是一个复杂的动态过程，主要包括炎性细胞浸润、成纤维细胞的活化、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积以及肾小管萎缩和微血管稀疏[1]。其中，炎症和氧化应激是肾纤维化发生的始动环节[2];同时，大量的ECM沉积被认为是肾纤维化形成的关键[2];此外，该过程还涉及多种细胞因子和信号通路，TGFβ1/p38MAPK通路便是其中关键的一条，其能调控多种靶基因，在肾纤维化的进展过程中发挥重要作用[3];而任何这些病理改变都能以其特有的方式促进肾小管间质纤维化的进展，并最终导致肾功能的丧失[5]。因此，靶向调节这些关键因素是减轻纤维化的重要策略。目前肾纤维化的治疗主要是通过控制血压、抑制肾素-血管紧张素系统和对症治疗为主[6]。值得注意的是，已经有最新研究指出，中药复方在减缓CKD早期患者肾纤维化过程中发挥着有益作用[7-9]。益血降浊汤是本科根据临床经验总结的协定方，多年来应用于CKD的防治，已取得了良好的临床疗效，笔者前期的研究已经证实，益血降浊汤能缓解CKD患者的临床症状、纠正贫血、调节血脂、减轻高凝和微炎症状态以及改善肾功能的作用[10-12]，但其作用机制尚未阐明。因此，本实验以单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠为研究对象，观察益血降浊汤对UUO大鼠炎症、氧化应激和纤维化的影响以及TGF-β/p38MAPK通路相关蛋白表达情况，进而探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1动物健康雄性SD大鼠42只，体重（200±20）g，购于西安交通大学动物实验中心。动物实验方案经西北大学动物使用委员会批准，在西北大学动物实验中心喂养，所有大鼠给予标准饲料，并自由饮水。

1.2药物与主要试剂益血降浊汤免煎颗粒配方（黄芪30 g，生地、丹参各20 g，山茱萸、淫羊藿、莪术、制首乌、泽兰、川芎各15 g，生大黄6 g），马来酸依那普利片（规格10 mg，亚宝药业集团股份有限公司，国药准字H14023578）购于陕西省中医医院药剂科;主要试剂：NF-kB、MCP-1、COX-2、Nrf2、HO-1、α-SMA、Collagen I、Collagen III、Vimentin、Fibronectin、TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、ASK-1、p-MKK3/6和p-ATF2（美国Abcam公司）。

1.3主要仪器病理切片机（RM2016，德国Leica公司）;光学显微镜（CX31，日本OLYMPUS公司）;垂直电泳槽（VE180，上海天能科技有限公司）;转移电泳槽（VE-186，上海天能科技有限公司）;全自动化学发光图像分析系统（Tanon 6100，上海天能科技有限公司）。

1.4动物分组和给药将42只大鼠随机分成6组（n=7）：假手术组和UUO组以等容量（2 mL/100 g）的蒸餾水灌胃;UUO+依那普利组用马来酸依那普利片按成人等效剂量1.05 mg/kg灌胃;UUO+益血降浊汤低、中、高剂量组（分别予益血降浊汤免煎颗粒1.418 g/kg，2.835 g/kg，5.670 g/kg灌胃），各组按以上方案灌胃，每天1次，连续给药2周。

1.5造模使用200±20 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，于左侧背部肋下约0.5cm处切口，纵向逐层切开皮肤肌层至腹腔，游离左侧肾脏及输尿管，以4-0无损伤丝线两次结扎左侧输尿管，制备UUO模型。逐层缝合，送回笼中饲养。假手术组大鼠的输尿管暴露，但未结扎。

1.6取材6组大鼠于手术后2周处死。留取处死前一天24 h尿量。各组大鼠称重后，予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，颈动脉取血后立即脱颈处死，解剖后迅速分离左肾，分为2份，一份浸泡于10%甲醛中固定，肾脏组织脱水后用蜡块包埋，并制作石蜡切片用于Masson和IHC染色;另一份于液氮中冻存用于Western Blot检测。

1.7方法及检测指标

1.7.1体重与尿量每日测大鼠体重，并于处死前一天留取大鼠24 h尿量。

1.7.2氧化应激相关指标的检测于大鼠颈总动脉取血后送检于上海远慕生物科技有限公司，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测MDA、SOD和ROS含量。

1.7.3Masson染色取肾脏组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，并制成5μm石蜡切片，按照常规方法行Masson染色，在200倍光学显微镜下观察肾脏组织形态学变化并拍照。使用Image-Pro Plus软件进行图像分析。

1.7.4免疫组织化学染色（immunohistochemistry，IHC）观察肾脏组织中COX-2、Collagen I和p-p38MAPK表达情况。常规制备5μm石蜡包埋的大鼠肾组织切片，烤片后经过3次二甲苯脱蜡水化，分别用甲醇和蒸馏水洗涤。向切片加入3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶活性。通过微波在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行抗原修复15 min。滴加5%山羊血清封闭液于湿盒中孵育15 min，滴加一抗，4℃过夜。次晨洗片后加用二抗孵育（37℃、40 min），DAB显色（室温，镜下控制反应时间），苏木精复染2 min，蒸馏水洗涤、氨水反蓝、透化、中性树胶封片，在200倍光学显微镜下观察。使用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析。

1.7.5蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）检测UUO大鼠肾组织中与炎症、ECM以及TGF-β1/p38MAPK通路相关蛋白表达情况 将60mg肾脏组织剪碎，磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗，离心后加裂解液，匀浆，再离心取上清（即总蛋白），提取蛋白后，用BCA法测定蛋白浓度，通过Tris-甘氨酸溶解凝胶分离20-30μg总蛋白，并转移至0.45μm PVDF膜上。在5%脱脂奶粉封闭缓冲液中温育1 后，将膜在4℃下与第一抗体一起温育过夜。次日洗涤后滴加二抗，于摇床上室温孵育1h，取出PVDF膜，显色液显色，全自动化学发光图像分析系统扫描光密度，使用Image J软件测定各蛋白的相对光密度值，以α-微管蛋白（α-tubulin）为参照。

1.8统计学分析采用GraphPad Prism软件进行统计学分析。计量资料数据用（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1益血降浊汤对UUO大鼠体重与尿量的影响通过分析大鼠体重和尿量的数据，笔者观察到，UUO模型大鼠的体重和尿量较假手术组明显下降，而益血降浊汤（低、中、高）和依那普利均能逆转体重和尿量的减少。值得注意的是，UUO大鼠体重和尿量的增长与益血降浊汤的剂量呈正相关，且高剂量的益血降浊汤效果最显著。但高剂量的益血降浊汤和依那普利相比，并未显示出明显差异（图1 A、B）。

2.2益血降濁汤对UUO大鼠肾组织病理改变的影响在Masson染色中，假手术组大鼠肾脏未见明显组织形态学异常，而UUO模型大鼠的肾脏显示出严重的肾小管扩张、管腔形态不规则、肾间质炎性细胞浸润、肌成纤维广泛表达（红色）和点片状胶原纤维沉积（蓝紫色）。通过益血降浊汤（低、中、高）和依那普利治疗后，上述病理改变明显减轻，其中尤以益血降浊汤高剂量组最为显著。并且其作用与依那普利相似（图1 C）。

（A）体重相对定量数据;（B）尿量相对定量数据;（C）各组大鼠肾组织Masson染色代表性显微照片，显示各组大鼠肾脏炎症和纤维化病变（放大倍数：×200）。与假手术组（n=7）相比，*P<0.05，**P<0.01。与UUO组（n=7）相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3益血降浊汤对大鼠氧化应激相关指标的影响检测结果表明：与假手术组比较，UUO导致大鼠ROS、MDA水平显著升高，SOD活性明显降低。与UUO模型组相比，益血降浊汤（低、中、高）和依那普利均能促进大鼠血液中SOD含量的增加并降低ROS和MDA的水平。虽然益血降浊汤（高）升高SOD的效果优于依那普利，但在降低ROS和MDA方面并没有显著差异（图2 A、B和C）。

2.4益血降浊汤对UUO大鼠肾组织炎症相关蛋白的影响IHC结果表明：假手术组未见COX-2明显表达，而UUO组可见COX-2在肾小管大量堆积且排列紊乱（棕黄色），当给予益血降浊汤高剂量和依那普利治疗后，COX-2的表达减弱（图2 D）。因益血降浊汤（低、中）组变化不明显，故未列出。类似的Western Blot结果显示，与假手术组相比，UUO模型组大鼠NF-κB、MCP-1、COX-2的表达明显升高，Nrf2、HO-1的表达显著减低;相比于UUO组，通过益血降浊汤（低、中、高）以及依那普利治疗后，能减弱NF-κB、MCP-1、COX-2的表达，并增加Nrf2及其靶基因HO-1的表达。特别是益血降浊汤高剂量变化最为显著，其抗炎作用优于依那普利且与剂量呈正相关（图2 E、F）。

2.5益血降浊汤对UUO大鼠肾组织ECM相关蛋白的影响与假手术组相比，UUO组大鼠α-SMA、Collagen I、Collagen III、Vimentin和Fibronectin蛋白的表达明显升高;相比于UUO组，益血降浊汤（低、中、高）和依那普利治疗后，可抑制UUO大鼠α-SMA、Collagen I、Collagen III、Vimentin和Fibronectin的上调。值得注意的是，益血降浊汤高剂量组显示出与依那普利相似的抑制ECM沉积的作用（

图3 A、B）。类似的IHC染色结果显示，UUO模型中Collagen I在肾间质区域广泛沉积（棕黄色），当给予益血降浊汤和依那普利治疗后，能减少Collagen I表达，且高剂量的益血降浊汤与依那普利作用相似（图3 C）。因益血降浊汤（低、中）组变化不明显，故未列出。

2.6益血降浊汤对UUO大鼠TGFβ1/p38MAPK通路相关蛋白的影响与假手术组相比，UUO组大鼠TGF-β1、ASK-1、p-MKK3/6、p38MAPK、p-p38MAPK、p-ATF2蛋白的表达明显升高;相比于UUO组，使用益血降浊汤（低、中、高）和依那普利治疗后，能下调TGF-β1诱导的ASK-1和p38MAPK表达，降低MKK3/6、p38MAPK和ATF2磷酸化水平，其中益血降浊汤高剂量组下降最为明显，且与用药剂量呈正相关（图4 A、B、C、D）。同时，笔者在免疫组织化学检测中发现，UUO组中p-p38MAPK阳性蛋白于细胞核中活跃表达。而通过益血降浊汤高剂量和依那普利治疗后，p38MAPK的磷酸化表达明显减弱，且高剂量的益血降浊汤与依那普利作用相似（图4 E）。因益血降浊汤（低、中）组变化不明显，故未列出。

3讨论

炎症在CKD发生和发展中扮演着重要角色[13]。炎症因子可刺激肾脏损伤部位的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，从而诱导ECM的产生和沉积，促进肾小管间质纤维化[14]。许多促炎细胞因子均受NF-κB调控，在炎症反应期间，游离的NF-κB被释放并转移到细胞核以转录促炎因子[15]，NF-κB的激活伴随着炎症因子的上调和抗氧化系统的下调[16];MCP-1能调节单核/巨噬细胞的募集和分化[17]，是导致炎症细胞浸润到肾脏中的主要分子[18]，在肾病的进展中发挥致病作用;COX-2作为介导炎症的重要蛋白之一，在受到应激时大量表达。通过抑制这些炎症反应关键调节因子的表达是目前治疗CKD最有吸引力的靶点[19]。细胞保护因子Nrf2和HO-1在改善炎症等方面发挥有益作用[20]。Nrf2是抗炎、抗纤维化的关键因子[21];Nrf2的激活决定抗氧化因子HO-1的合成，同时HO-1能够保护细胞免受氧化损伤，降解游离血红素和抑制ROS产生[22]。已经有研究报道，协同上调Nrf2和HO-1的表达水平可以保护细胞免受氧化和凋亡的损害[20]。本研究发现，IHC染色观察到COX-2在UUO组中大量表达，当给予血降浊汤治疗后，COX-2的沉积明显减少。Western Blot检测出肾组织中NF-κB、MCP-1、COX-2的表达较UUO组明显降低、细胞保护因子Nrf2、HO-1的表达显著提高。这些结果提示，益血降浊汤能够减少促炎因子表达和增加抗炎因子的释放，从而减轻肾损伤。

氧化应激是由ROS产生和清除之间的不平衡引起的，同时，ROS能诱导许多异常信号传导途径，如炎性细胞浸润等[23]，在CKD中起关键作用[24]。氧化应激作为一种诱导细胞凋亡的初始信号[25]，在生理条件下，引起抗氧化和细胞保护蛋白上调，以防止功能障碍和肾损伤;病理状态下，氧化应激通过多种途径触发炎症，而炎症主要通过细胞产生活性氧而造成氧化应激，氧化应激和炎症相互作用，形成恶性循环，加重肾损伤[16]。MDA作为一种生理性酮醛，由不饱和脂质过氧化物分解产生，是花生四烯酸代谢的副产物，MDA水平的高低一定程度上反应了氧化应激引起的细胞损伤程度[26]。而SOD被认为是一种具有保护细胞功能的抗氧化酶，可以使机体免受各种损伤的侵害。研究发现，SOD含量的增加，能使ROS、MDA和细胞凋亡减少[27]。因此，本实验研究选取ROS、MDA和SOD作为检查氧化应激的相关指标。结果显示，高剂量的益血降浊汤能显著增加大鼠血液中SOD的含量，并降低ROS和MDA含量。提示益血降浊汤可能通过减少ROS和MDA的产生，同时增加抗氧化物SOD的活性参与肾保护。

肾纤维化的主要特征在于肾小管和肾小管周围毛细血管之间的区域病理性纤维状基质的沉积。在病理条件下，肾小管上皮细胞可能会分化成间充质细胞和活化的成纤维细胞，通过趋化因子最终形成肌成纤维细胞，该过程被称为上皮间质转分化（EMT）[28]，EMT是肾间质纤维化发生的重要机制，在EMT过程中，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、Vimentin和Fibronectin蛋白的表达均增加[29]，这些蛋白同样是ECM的重要组成成分。α-SMA是肌成纤维细胞的特征性标志蛋白，也是肾间质纤维化发生的关键[30]。在ECM中Collagen I、Collagen Ⅲ提供主要的结构支撑，其表达量的多少在一定程度上反应了肾间质纤维化的程度。中间丝家族蛋白Vimentin，主要表达于间充质细胞中，作为细胞的骨架结构在炎症和多种自身免疫系统疾病中起作用[31]。Fibronectin也是ECM的关键成分，能够整合蛋白受体以及形成ECM结构成分之间所必需的连接，更是许多其他ECM蛋白沉积的基础[32]。因此本实验综合检测这些关键蛋白，能更好的反应肾纤维化的变化情况。本研究发现，通过益血降浊汤治疗后，IHC和Masson染色结果显示，有效的减轻了Collagen I的表达以及肾脏组织病理学改变。同样的结果也在Western Blot检测中得到证实，大鼠肾组织中α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、Vimentin和Fibronectin的表达均较UUO组下降。提示益血降浊汤在一定程度能够通过阻断ECM的过表达而改善肾纤维化。

TGFβ1/p38MAPK信号通路响应各种炎症、氧化应激和其他刺激而被激活，在肾纤维化过程中起关键作用。而抑制该通路的活性能够减缓肾纤维化的进展[3]。TGF-β1、ASK-1、p-MKK3/6、p38MAPK、p-p38MAPK和p-ATF2是该通路上关键的蛋白分子。TGF-β1在受到各种刺激后被激活，进一步影响下游因子ASK-1的活化，ASK-1的过表达促进MKK3/6磷酸化。作为上游因子的MKK3/6是p38MAPK主要的激活剂，被激活的p38MAPK通过磷酸化产生p-p38MAPK，促进ATF2的磷酸化，从而产生一系列生物活性反应。TGF-β1是最普遍的促纤维化细胞因子之一[33]，其最重要的生物学作用是调节细胞外基质，目前已经被证实TGF-β1的增加与肾纤维化密切相关[3];ASK-1是氧化应激诱导的炎症和纤维化的关键调节剂[34]，众所周知，各种类型的细胞毒性应激物通过产生过量的ROS激活ASK-1，从而诱导细胞凋亡[35];MKK3/6、p38MAPK以及ATF2具有非磷酸化和磷酸化两种形式，其通过转化为磷酸化状态进一步刺激下游底物的磷酸化，实现信号传递。因此磷酸化的蛋白更能反映真实的蛋白活性。MKK3/6是TGFβ1/p38MAPK信号通路主要信号传导亚群之一，可以特异性磷酸化和激活p38MAPK，是与凋亡和炎症密切相关的蛋白激酶[36];p38MAPK是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，过度的刺激如炎症、氧化应激可以激活p38MAPK导致细胞功能障碍[37];p-p38MAPK作为p38MAPK磷酸化的产物，可以进入细胞核内，参与调控多种核转录因子如NF-κB，导致炎症的发生;ATF2是DNA结合蛋白的亮氨酸拉链家族的成员，主要参与调节细胞应激反应，磷酸化的ATF2在细胞凋亡和炎症中起关键作用[38]，研究表明ATF2在多种炎症反应中发挥作用[39，40]。本次研究发现，UUO大鼠通过益血降浊汤治疗2周后，该通路上TGF-β1、ASK-1和p38MAPK的活性被明显抑制，同时MKK3/6、p38MAPK以及ATF2磷酸化水平显著降低。提示益血降浊汤发挥肾脏保护作用的机制可能是通过抑制TGFβ1/p38MAPK通路，减少磷酸化水平产生的。

UUO是使用最广泛的间质纤维化模型，能够迅速导致肾间质纤维化、炎症、肾小管和间质细胞的凋亡，与CKD患者组织病理学变化基本一致[41]。本次研究也证实，造模成功的UUO大鼠肾脏中，其炎症、氧化应激和纤维化相关蛋白的表达较假手术组均明显升高，并且在不进行任何干预的条件下，其肾损伤的表现并未显示出缓解趋势。

中药在临床中广泛使用，并被认为是预防和治疗各种肾病的有效疗法[43]。越来越多的证据表明，单味中药[44-46]以及中药复方[47]中提取的许多化合物能通过多种途径来延缓CKD的进展。本次研究发现，益血降浊汤能逆转UUO大鼠尿量和体重的下降;降低ROS和MDA的水平，促进SOD的增加;Masson染色显示，經治疗后肾组织病理改变减轻;IHC染色显示，Cox-2、Collagen I和p-p38MAPK的表达在治疗后明显减少，这与Western Blot的结果相一致;Western Blot结果表明，经益血降浊汤治疗后Nf-κB，MCP-1、COX-2和α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin以及TGF-β1、ASK-1、p38MAPK、PMKK3/6、p-p38MAPK、p-ATF2的表达明显降低，而Nrf2和HO-1的表达显著增加。并且其作用与剂量呈正相关。以上结果均证实益血降浊汤对受损的肾组织具有修复作用。因此笔者推测，益血降浊汤肾保护的作用可能是多靶点的，通过调控TGF-β1/p38MAPK通路活性来改善炎症和氧化应激、减少ECM的沉积，抑制肾纤维化来发挥肾保护作用。综上所述，益血降浊汤可能是有希望的具有潜在抗炎、抗氧化、抗纤维化的中药复方，也为益血降浊汤后期深入研发奠定了基础。

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