FBN1基因c.2418A＞G突变对转录影响的研究

张岳 李金洁 刁艳君 杨柳 郝晓柯

原纤维蛋白-1（Fibrillin-1，FBN1）基因位于人15号染色体长臂（15q21.1），包含66个外显子，其编码的原纤维蛋白-1由2 871个氨基酸组成。原纤维蛋白-1是一种富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，参与细胞外基质中10～12 mm微纤维的组成并形成弹性纤维，为主动脉及其他结缔组织提供韧性和受力支撑［1］。当FBN1基因突变时原纤维蛋白-1结构及活性发生改变，干扰细胞外基质中微纤维的形成，从而破坏细胞外基质的稳定结构，削弱主动脉壁中膜弹性进而导致主动脉瘤和夹层的发生［2］。

胸主动脉瘤和夹层（Thoracic aortic aneurysm and dissection，TAAD）是一类以胸主动脉扩张、主动脉瘤或夹层为主要特征的主动脉疾病，既往无致病因素的早发性胸主动脉瘤患者通常具有较强的遗传倾向。遗传性TAAD约占20%，在临床上分为综合症型和非综合症型。其中，非综合症型以心血管系统异常表现为主，不累及其他结缔组织和系统，一般为常染色体显性遗传［3］。目前已知FBN1基因突变是导致马凡综合征（Marfan syndrome，MFS）的主要原因，但有文献报道4%的非综合症型TAAD与FBN1基因突变有关［3-4］。本研究对1名早发性胸主动脉瘤患者的15个与遗传性主动脉疾病相关基因进行组合检测（包括FBN1、FBN2、 TGFB2、 TGFBR1、 TGFBR2、 SMAD3、SMAD4、MYH11、ACTA2、MYLK、COL3A1、SLC2A10、NOTCH1、PRKG1 基因）［5］，寻找该患者的致病基因并探讨分子致病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

患者30岁男性，身高185 cm，体重90 kg，血压106/76 mmHg。心脏彩超提示升主动脉及主动脉窦部内径瘤样增宽（升主动脉58 mm，主动脉窦部55 mm），主动脉弓内径增宽，升主动脉至降主动脉内膜与管壁剥离，主动脉瓣先天性发育不良伴返流，其他系统尚无阳性发现。患者来源于西京医院，该研究获得本医院伦理委员会批准，并经患者知情同意后签署书面知情同意书。

1.2 材料

Hela细胞和质粒pcDNA3.1（-）由本科室提供；胎牛血清购自BI公司；DMEM培养基购自吉诺生物；TRIzolTMReagent试剂及转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；高保真酶（PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase）、逆转录试剂盒（PrimeScript™RT Master Mix）、T4 DNA连接酶、EcoRI和HindIII限制性内切酶以及实时荧光定量PCR试剂盒（TB Green™Premix Ex Taq™II）购自大连宝生物公司；胶回收试剂盒（QIAquick®Gel Extration Kit）购自德国 QIAGEN公司；感受态细胞DH5α购自中国Solarbio公司；引物合成和Sanger测序由西安擎科生物公司负责。

1.3 方法

1.3.1 基因检测及突变分析

采集4 mL患者外周静脉血并经EDTA-K2抗凝，按照核酸自动提取仪的标准化操作流程提取基因组DNA（仪器及试剂盒均有西安天隆科技有限公司提供），并用Qubit 2.0荧光定量仪（美国赛默飞公司）检测基因组DNA浓度。使用遗传性心血管疾病基因检测试剂盒（北京诚真基因生物技术有限公司），按照其说明书对样本进行基因检测。测序所需的ABI 9700型PCR仪、ABI 2720型PCR仪，Ion ChefTMSystem、Ion Torrent PGM及Ion Torrent 318 v2芯片、Ion PGMTMHi-QTM试剂盒均由美国赛默飞公司提供。

基因检测结果通过CoverageAnalysis及VariantCaller与人类基因组参考序列hg19（GRCh37）进行比对，采用Ion ReporterTM对所有的变异位点进行注释，筛选出可疑突变位点并用Sanger测序法进行验证，验证结果根据美国医学遗传学与基因组学学会制定的《遗传变异分类标准与指南》［6］判定突变位点的致病性质。对判定为致病、可能致病或临床意义未明患者的家属相同突变位点进行Sanger测序。

1.3.2 生物信息学分析

使用dbscSNV数据库、Mutation Taster和Human Splicing Finder（HSF）等生物信息学软件分析突变对剪接位点分值的影响。

1.3.3 Minigene技术

1.3.3.1 重组载体构建 以健康人和患者基因组DNA作为模板，使用高保真酶和F-EcoRI、R-HindIII扩增目的片段（包括Exon19 71 bp、Intron19 1040 bp、Exon20 126 bp、Intron20 511 bp和 Exon21 53 bp），扩增条件为 98℃预变性 5 min，98℃变性10 s，60℃退火 5 s，68℃延伸 4 min，30 个循环；4℃保温。1 817 bp基因组片段（其5′端包含EcoRI酶切位点，3′端包含HindIII酶切位点）和质粒pcD-NA3.1（-）经酶切纯化后于16℃连接过夜，连接产物以热激法转化感受态细胞DH5α，经氨苄青霉素抗性筛选的单克隆菌落进行PCR和测序鉴定。相关引物序列如表1所示。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.3.3.2 细胞培养与转染 Hela细胞用含15%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。转染前1 d，胰酶消化Hela细胞并调整细胞密度为2.5×105个/mL，接种到6孔板，培养24 h使其贴壁。按照Lipofectamine 3000说明书转染两种重组质粒进行瞬时表达，48 h后收集细胞。

1.3.3.3 qPCR与Sanger测序 TRIzol法提取Hela细胞总RNA，测定浓度并反转录为cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书，以F-EcoRI、R-HindIII为引物进行qPCR。设置程序：95℃30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s，40 个循环；溶解曲线；以 GAPDH为参照物检测FBN1基因mRNA的表达水平，记录每个反应的Ct值，以2-ΔΔCt公式计算基因相对倍比关系。相关引物序列如表1所示。实验重复3次。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析目的片段大小是否改变，纯化后测序分析。

1.3.4 血液淋巴细胞RNA验证

提取患者和健康人血液中淋巴细胞的RNA并反转录为cDNA，以F-EcoRI、R-HindIII为引物进行常规PCR，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析患者目的片段大小是否改变，回收纯化后测序分析。此外，分别针对 Exon 4～6、Exon 25～26 和 Exon 55～56设计引物通过qPCR分析3个外显子区域mRNA的表达水平，验证异常mRNA是否发生完全降解。相关引物序列如表1所示。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析并作图，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异，有统计学意义。

2 结果

2.1 家系分析

经基因检测和Sanger测序证实患者FBN1基因第20号外显子存在c.2418A＞G杂合突变，其他基因未发现可疑致病性突变。通过口腔拭子对其家族成员相同位点进行Sanger测序，发现患者父亲该位点为杂合突变，经全面体格检查尚未发现心血管系统存在异常表现。此外，患者女儿因未满1周岁而未进行基因检测，其余亲属基因检测均无阳性发现。家系图谱见图1。

图1 本例TAAD家系图Figure 1 The family tree of TAAD

表2 dbscSNV数据库预测结果Table 2 dbscSNV database prediction results

2.2 c.2418A＞G突变影响FBN1基因剪接

2.3 Minigene技术验证结果

2.3.1 重组表达载体鉴定

野生型和突变型重组表达载体分别命名为WT和MUT。菌落PCR电泳（图2A）和Sanger测序（图2B和2C）证实载体构建成功，MUT已引入c.2418A＞G突变。

2.3.2 qPCR及测序结果

qPCR检测结果（图3A）所示，与WT-Hela细胞相比，MUT-Hela细胞内FBN1基因mRNA的相对表达量明显降低（t=3.354，P＜0.01）。PCR产物电泳（图3B）显示，两种细胞内的扩增片段大小均为266 bp，Sanger测序发现（图3C和图3D）2种产物的序列完全一样，内含子被去除并且外显子正确地连接在一起，并且MUT-Hela细胞扩增片段内原有的突变位点消失。

表3 HSF和Mutation Taster预测结果Table 3 HSF and Mutation Taster prediction results

图2 WT和MUT鉴定结果Figure 2 Identification results of WT and MUT

图3 细胞转染结果Figure 3 Experimental results of cell transfection

2.4 血液淋巴细胞RNA验证结果

常规PCR产物电泳（图4A）显示患者与健康人目的片段大小均为266 bp，患者常规PCR产物测序也明确c.2418A＞G突变位点的消失（图4B）。qPCR结果（图4C）显示，与健康人相比，患者血淋巴细胞内FBN1基因mRNA的相对表达量在3个不同外显子区域明显降低（t=4.979，P＜0.01；t=3.243，P＜0.05；t=5.017，P＜0.01），提示异常 mRNA发生完全降解。

图4 血液淋巴细胞RNA实验结果Figure 4 Experimental results of Blood lymphocyte-derived RNA

3 讨论

胸主动脉瘤和夹层是一种致命性主动脉疾病，约20%具有遗传性，包括MFS、Loeys-Dietz综合征、Ehlers-Dalos综合征以及非综合征性TAAD等。随着对遗传性TAAD认识的不断深入，人们已经筛选出11种强致病基因［5］，临床医生可以利用基因检测技术在患者症状完全表现之前进行初步诊断，对患者家属进行筛查和患者手术方案的选择及预后判断也有一定的指导作用［7］。在本研究中，该患者除主动脉瘤和夹层症状外无其他部位的异常表现，不符合典型MFS的诊断标准［8］。患者为青年男性，存在胸主动脉瘤和夹层以及主动脉瓣先天畸形，排除了高血压等后天疾病和创伤对主动脉的影响，考虑为非综合征型TAAD，其主动脉疾病表型可能受到遗传因素的影响。因此本研究选择15个与遗传性主动脉疾病相关的基因对患者进行检测，并通过Sanger测序法确认该患者FBN1基因第20号外显子存在c.2418A＞G杂合突变。

外显子与内含子交界处的经典剪接区域在RNA剪接过程中提供供体剪接位点和受体剪接位点，发生突变时可能会导致外显子跳跃、内含子的保留和内含子中假外显子的产生等［9］。影响mRNA剪接的突变在FBN1突变中约占10%，部分剪接突变还会介导mRNA发生降解［10-11］。c.2418A＞G突变位于FBN1基因第20号外显子3’端，属于经典剪接序列，但现有文献和临床资料未能证实该突变的致病性质以及是否会引起mRNA的异常剪接。ClinVar数据库根据《遗传变异分类标准与指南》暂时将该突变归为临床意义未明。因此，本研究在体外模拟了c.2418A＞G突变对转录过程的影响，同时还分析了患者的血样，均没有发现含有突变位点的mRNA并且mRNA相对表达量低于健康对照。综合上述两种实验结果，c.2418A＞G突变使异常mRNA发生了降解，从而使mRNA表达水平下降，因此在测序时没有检测到异常mRNA而造成假阴性结果。该突变使得体内mRNA含量减少从而造成FBN1单倍体不足，削弱主动脉壁中膜弹性进而导致患者发生主动脉瘤和夹层［12-13］，如果获得患者的结缔组织标本应检测组织内FBN1的含量和组织病理情况加以验证。

虽然非综合征型TAAD具有一定常染色体显性遗传，但遗传异质性较强，很多综合征型TAAD的致病基因也可导致非综合征型TAAD［14-15］。不同非综合征型TAAD家系的外显率不一，突变并不是在所有的家族成员中共分离，其中FBN1基因突变就存在未受影响的突变携带者［16］。此外，非综合征型TAAD外显率还与发病年龄相关，Yale-New Haven医院对598名胸主动脉瘤患者进行分析［17］，非综合征型TAAD患者的平均发病年龄（56.8岁）显著高于MFS患者（24.8岁）。患者的父亲（50岁）尚未达到非综合征型TAAD的平均发病年龄，本研究应继续密切关注其主动脉及全身其他动脉的变化，定期随访。

综上所述，本研究证实了c.2418A＞G会使异常mRNA发生降解，并认为患者主动脉疾病的临床表现与原纤维蛋白-1减少导致主动脉脆性增强有关。希望该实验结果能为FBN1基因c.2418A＞G突变致病性质的研究提供临床资料和参考证据，进而对遗传性TAAD的产前咨询和诊断有所帮助。