响应面法优化阿魏菇多糖的超声辅助提取工艺及抗氧化活性研究

丛媛媛，阿依江·哈拜克，米仁沙·牙库甫，帕丽达·阿不力孜

（新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830011）

阿魏菇，学名阿魏侧耳（Pleurotus ferulae Lanzi），亦名准噶尔阿魏侧耳（Pleuratus eryngii（Dc.：ex.Fr.）Quel.var.ferulae Lanzi），隶属于真菌门担子菌纲伞纲目口蘑科（Tricholomataceae）侧耳属（Pleurotus（fr.）kumm.），在我国野生阿魏菇仅分布于新疆木垒、塔城、阿勒泰和青河等地的沙漠戈壁里，是寄生或腐生在新疆荒漠药用植物阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）上的一种具有药用价值的珍稀食用菌[1-2]。过去由于过度采摘和牲畜践踏，自然资源遭受严重破坏，野生阿魏菇逐年减少。直至1983 年，新疆生物沙漠土壤研究所驯化栽培了阿魏菇，并于1990 年选育出高产菌株，其后在新疆和福建等省区推广并进行了较大规模的生产[3]。阿魏菇具有很高的食用和药用价值，其子实体脆嫩可口，香味浓郁；又因其具有行气、消积、杀虫等功效，中医可用于治疗胃痛、食积、虫积等[4]，国外学者则报道阿魏菇的子实体具有抗高血脂、抗肿瘤和免疫调节活性[5-7]。对其药效物质基础的研究则表明，阿魏菇中含有的多糖（Pleurotus ferulae polysaccharides，PfP），是与其药效密切相关的一类重要化学成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药理活性[8-13]。

为了进一步研究阿魏菇多糖PfP 的结构及活性，传统水浴浸提法[14]、超声波法[15]等提取方法多用于PfP的提取，但采用响应面法优化PfP 的超声辅助提取工艺的研究鲜见报道。本课题组前期采取水提醇沉方法提取了PfP，对其急性毒性和抗炎作用进行了初步研究[13]，并采用薄层色谱法和气相色谱法PfP 的单糖组成进行了分析[16]。本文以新疆地产阿魏菇为研究对象，选择超声时间、超声温度、液料比及提取次数对多糖提取率有影响的4 个因素，以阿魏菇多糖的提取率为考察指标，进行单因素试验；并在此基础上采用中心组合设计（box-behnken design，BBD）和响应面方法（response surface methodology，RSM），对超声辅助法提取阿魏菇多糖的提取工艺进行优化；同时对所提取的PfP 从还原能力、清除DPPH 自由基、羟基自由基等方面进行体外抗氧化活性研究，为今后进一步研究阿魏菇多糖的综合开发利用积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

阿魏菇：新疆红杏生态农业有限公司，由新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜鉴定为阿魏侧耳（Pleurotus ferulae Lanzi）。

DPPH、葡萄糖：美国Sigma 公司；抗坏血酸：上海融禾医药科技发展有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、水杨酸：天津永晟精细化工有限公司；苯酚：天津市鼎盛鑫化工有限公司；硫酸、乙醇：天津福晨化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。

T6 新世纪型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Sartorius AL104 电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ5200DE 型超声仪：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿魏菇多糖超声辅助提取工艺

阿魏菇干燥、粉碎后，取适量粉末加入一定量水进行超声处理，提取数次，合并提取液后过滤，滤液浓缩至一定体积，加数倍量体积的无水乙醇沉淀过夜，离心后取沉淀干燥即为阿魏菇多糖。多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法[17]，多糖的提取率用下式计算：

阿魏菇多糖提取率/%=阿魏菇多糖质量（g）/阿魏菇干质量（g）×100。

1.2.2 单因素试验

在超声时间分别为 10、20、30、40、50 min，超声温度分别为 20、30、40、50、60 ℃，液料比分别为 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g），提取次数分别为 1、2、3、4、5 的条件下，按照 1.2.1 的方法和多糖提取率计算方法，进行超声时间、超声温度、液料比、提取次数4个因素对阿魏菇多糖提取率的影响试验。

1.2.3 响应面法优化阿魏菇多糖的超声提取工艺的试验设计

在单因素试验结果基础上，采用BBD 和RSM 方法，对超声辅助法提取阿魏菇多糖的影响因素进行研究和条件优化，做出响应面图，建模并分析各因素对响应值的影响[18-20]。

1.2.4 阿魏菇多糖体外抗氧化活性研究

1.2.4.1 阿魏菇多糖还原能力测定

参照文献[21-22]，采用铁氰化钾还原法测定阿魏菇多糖还原能力：取PfP 适量，用蒸馏水配成0.5 mg/mL～4.0 mg/mL 梯度的溶液，取 1 mL 待测液，加入 pH6.6 的磷酸盐缓冲液2.5 mL 和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，混合后在50 ℃放置20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，4 800 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.1%氯化铁2.5 mL，混匀，静置10 min，在700 nm 处测定吸光度，平行测定3 次，取平均值。同时测定VC的还原能力，作为阳性对照。

1.2.4.2 阿魏菇多糖对DPPH 自由基清除能力测定

参照文献 [21-22]，取各浓度阿魏菇多糖溶液（0.5 mg/mL～4.0 mg/mL）2mL 及 1×10-4mol/L DPPH 溶液2 mL 加入具塞试管中摇匀，在室温（23 ℃）下密闭静置30 min，用纯溶剂作参比，于517 nm 波长下测定吸光度，平行测定3 次，取平均值。同时测定VC的DPPH 自由基清除能力，作为阳性对照。根据下列公式计算每种提取液对DPPH 自由基的清除率：

式中：A1为加多糖溶液后DPPH 溶液的吸光度；A2为多糖溶液的吸光度；A0为未加多糖溶液时DPPH 溶液的吸光度。

1.2.4.3 阿魏菇多糖对羟自由基（·OH）的清除试验

参照文献[23-24]，利用邻二氮菲法，精确移取1 mL 0.75 mmol/L 的邻二氮菲溶液、2 mL pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液和1mL 双蒸水，摇匀，再加入1 mL 0.75 mmol/L 的硫酸亚铁溶液，摇匀，最后再加入1 mL 0.01%过氧化氢溶液，37 ℃恒温水浴60 min，在510 nm波长处测定其吸光度，记作A损；另一比色管中用1 mL双蒸水代替1 mL 过氧化氢，测定其吸光度，记作A未；再在一比色管中用不同浓度的VC对照溶液或阿魏菇多糖溶液（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/mL）代替 1 mL 双蒸水，在510 nm 波长处测其吸光度，记作A样，平行测定3 次，取平均值，按下式计算其清除率：

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间对阿魏菇多糖提取率的影响

在液料比 20 ∶1（mL/g）、超声温度 60 ℃、提取两次的条件下，超声时间对阿魏菇多糖提取率的影响结果见图1。

图1 超声时间对阿魏菇多糖提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of PfP

由图1 可知，PfP 的提取率在提取时间10 min 至50 min 之间呈逐渐上升的趋势，在30 min 时提取率达到最高（13.41%），之后趋于下降。表明超声时间在一定范围内可以增加PfP 提取率，但长时间的超声波作用可能会使大分子的多糖结构破坏，影响了提取率，因此选择超声时间30 min 作为BBD 试验的中心点。

2.1.2 超声温度对阿魏菇多糖提取率的影响

在液料比 20 ∶1（mL/g）、超声时间 30 min，提取两次的条件下，超声温度对阿魏菇多糖提取率的影响结果见图2。

图2 超声温度对阿魏菇多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temprature on the extraction rate of PfP

由图2 可知，PfP 的提取率在超声温度20 ℃至60 ℃之间呈逐渐上升的趋势，在60 ℃时提取率达到最高（11.89%）。表明在一定范围内，超声温度越高，PfP 提取率越大。因此选择超声温度60 ℃作为BBD 试验的中心点。

2.1.3 液料比对阿魏菇多糖提取率的影响

在超声时间30 min、超声温度60 ℃、提取两次的条件下，液料比对阿魏菇多糖提取率的影响结果见图3。

图3 液料比对阿魏菇多糖提取率的影响Fig.3 Effect of liquid/solid on the extraction rate of PfP

由图 3 可知，PfP 的提取率在液料比 10∶1（mL/g）至25∶1（mL/g）之间逐步增大，当料液比达到 25∶1（mL/g）时，PfP 提取率达到最大值（11.55%）；其后当料液比达到 30∶1（mL/g）时，PfP 提取率反而下降（10.77%）。因此选择液料比25∶1（mL/g）作为BBD 试验的中心点。

2.1.4 提取次数对阿魏菇多糖提取率的影响

在液料比 25∶1（mL/g）、超声时间 30 min、超声温度60 ℃的条件下，提取次数对PfP 提取率的影响结果见图4。

图4 提取次数对阿魏菇多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the extraction rate of PfP

从图4 可知，提取2 次即达到较好的效果，PfP 提取率为10.37%；3、4 次提取与2 次提取的提取率相比则有下降的趋势。因此选择两次提取作为BBD 试验的中心点。

2.2 阿魏菇多糖提取工艺的响应面法优化

根据BBD 原理，结合单因素试验结果确定超声温度（X1）、液料比（X2）、超声时间（X3）3 个因素的水平范围，将PfP 提取率作为响应值，进行三因素三水平的响应面分析。试验因素与水平设计见表1，响应面分析方案及试验结果见表2。

表1 试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 响应面法试验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

续表2 响应面法试验设计及结果Continue table 2 Response surface experiment design and results

采用Design-Expert8.0 软件对所得数据进行二次多项拟合回归，建立模型为：

Y=14.23+0.27X1+0.63X2+0.095X3+0.16X1X2+0.11X1X3-0.11X2X3-0.44X12-0.32X22-0.32X32

回归模型的方差分析结果见表3。

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

表3 回归统计分析结果表明，模型的F 值为13.19（P＜0.01），表明该模型极显著，具有统计学意义；失拟误差项的 P 值为 0.088＞0.05，且 R2=0.891 7，不显著。该结果显示模型的二次多项回归方程可以在不同提取条件下预测PfP 的提取率，试验方法可靠。表3 结果还表明，各试验因素对响应值的影响不是线性关系，作用显著的是模型中的一次项X2、X1和二次项X12、X22、X32，表明该试验的各因素对PfP 提取率有显著影响。由F 值可知，对PfP 提取率影响的大小依次为液料比、超声温度和超声时间，即液料比对PfP 提取率的影响最为显著。

图5～7 为通过回归模型而得到的PfP 提取率的响应曲面图和等高线图。

图5 超声温度和液料比对PfP 提取率交互影响的响应曲面图和等高线图Fig.5 Response and contour plot of synergetic effect of ultrasonic temprature and liquid/solid on the extraction rate of PfP

图6 超声温度和超声时间对PfP 提取率交互影响的响应曲面图和等高线图Fig.6 Response and contour plot of synergetic effect of ultrasonic temprature and ultrasonic time on the extraction rate of PfP

图7 超声时间和液料比对PfP 提取率交互影响的响应曲面图和等高线图Fig.7 Response and contour plot of synergetic effect of ultrasonic time and liquid/solid on the extraction rate of PfP

比较3 组图中的响应曲面图可知：液料比（X2）对PfP 提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡；而超声时间（X3）与超声温度（X1）对 PfP 提取率的影响次之，表现为曲线较为平滑。比较3 组图中的等高线图可知：X1X2、X2X3交互作用显著（等高线为椭圆形），X1X3交互作用不显著（等高线为圆形）。

通过Design Expert 8.0 软件分析得到的PfP 超声提取最优工艺条件为：超声时间26.67 min、超声温度65.56 ℃、液料比 28.96 ∶1（mL/g），最佳提取率预测值为14.54%。为了验证试验方案的有效性，并考虑实际操作的便利，将最佳工艺条件调整为：超声时间27 min、液料比 29 ∶1（mL/g）、超声温度 66 ℃，在此条件下进行3 次平行试验。结果PfP 提取率平均值为14.69%，与预测值相符，偏差较小，表明优化结果可靠，可用于阿魏菇多糖的提取。

2.3 阿魏菇多糖体外抗氧化活性研究

2.3.1 阿魏菇多糖还原能力测定

阿魏菇多糖对Fe3+还原能力的测定结果见图8。

图8 PfP 还原Fe3+的结果Fig.8 The results of reducing power

由图8 可以看出，在试验浓度范围内，阿魏菇多糖PfP 和对照品VC的质量浓度越大，其吸光值越大，表明对Fe3+的还原能力越强，还原能力与质量浓度的增加呈正相关性；当其质量浓度为4.0 mg/mL 时，使Fe3+还原产生的吸光度平均值为0.54，尽管比对照品VC的还原能力弱（A=0.979），对Fe3+仍显示出一定的还原能力。

2.3.2 阿魏菇多糖对DPPH 自由基清除能力测定

阿魏菇多糖对DPPH 自由基清除能力的测定结果见图9。

图9 PfP 对DPPH 自由基的清除能力Fig.9 The result of clean DPPH radical scavenging activity

由图9 可以看出，对照品VC具有极强的清除DPPH自由基的能力，最小试验浓度（0.25 mg/mL）VC的清除率即达到92.45%；而受试样品PfP 的质量浓度越大，其对DPPH 自由基的清除能力越强，其清除能力与质量浓度的增加呈正相关性，最大试验浓度组（4.0 mg/mL）PfP 对DPPH 自由基的清除率可达85.61%，虽然低于与同浓度对照品VC的清除率，仍显示出较强的DPPH自由基清除能力。

2.3.3 阿魏菇多糖对羟自由基（·OH）的清除试验

阿魏菇多糖对·OH 清除能力的测定结果见图10。

图10 PfP 对羟基自由基（·OH）的清除能力Fig.10 The result of clean·OH radical scavenging activity

从图10 可以看出，对照品VC具有极强的清除·OH的能力，而受试样品PfP 的质量浓度越大，其对·OH 的清除能力越强，其清除能力与质量浓度的增加呈正相关性，最大试验浓度组（4.5 mg/mL）PfP 对·OH 的清除率可达56.1%，虽然低于与同浓度对照品VC的清除率，仍显示出一定的·OH 清除能力。

3 结论

本文在单因素试验结果基础上，采用BBD 和RSM 方法对阿魏菇多糖PfP 的超声辅助提取工艺进行优化，并利用DPPH 自由基、羟基自由基的清除能力和Fe3+的还原力评价其体外抗氧化能力。结果显示，所建立的二次多项式数学模型拟合程度高，试验误差小，最佳提取工艺为：液料比为 29 ∶1（mL/g），66 ℃超声辅助提取27 min，在此条件下PfP 的提取率为14.69%；该工艺条件与文献报道的热水浸提阿魏菇多糖方法相比，节省大量时间，且提取温度较低；该超声辅助提取工艺条件下阿魏菇多糖提取率也高于已有的文献报道[15，25]，对实际应用操作具有一定的参考价值。体外抗氧化试验结果表明，按照最佳提取工艺提取的PfP具有较强的清除DPPH 自由基、羟基自由基的能力和一定的还原能力，具有开发成为天然抗氧化剂而用于功能性食品或药品的潜能。本文的研究结果可为阿魏菇多糖在功能性食品、药品等领域的深入开发提供一定的理论基础和参考。