乳浆大戟提取物诱导人肺癌细胞凋亡可能分子机制的探讨

郭姝彤，符兆英，艾彩莲

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

肺癌是目前全世界及我国发病率和死亡率最高的一种恶性肿瘤，近年来发病率持续升高，其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%～85%，虽然目前综合预防、治疗手段有很大进展，但是还不能有效地减少肺癌的发生率和死亡率，尤其是肺癌患者的5年存活率仍然较低[1]。肺癌的发生是一组多基因损伤变异的过程，涉及大量相关基因结构和表达调控的改变基因，其中原癌基因的活化、抑癌基因的失活起到重要的作用。恶性肿瘤的发生不仅与细胞的过度增殖关系密切，凋亡过程异常也是重要原因。目前临床治疗肺癌的药物不良反应较大，不能有效控制肿瘤的发生与发展，因此找到一种不良反应少的治疗肺癌的药物很关键[2]，而天然产物是近几年来抗肿瘤药物的重要来源，乳浆大戟作为一种天然产物，经查阅文献资料发现目前国内极少数的人在研究乳浆大戟作用于肺癌，国外更是几乎没有发表这方面的研究成果，因此，本文探讨了其有效成分对肺癌细胞的诱导及其可能作用机制的研究，不仅对临床寻找新的治疗药物具有重要的意义，而且给学者对传统中草药的研究提供一个新的思路。

1 乳浆大戟简介

乳浆大戟(Euphorbia esula)多年生草本[3]，折断后流白色乳汁，生长于山坡草地或沙质地上[4]，分布于东北、华北及陕西、宁夏、甘肃等地[5]，我国南北均产，尤以西南的横断山区和西北地区较多。春夏采收，鲜用或晒干用，有重要的药用价值[6]。乳浆大戟为大戟科植物乳浆大戟的全草，乳浆大戟草又名猫眼草[7]，两者从植株形态上难以区分，在中药中，乳浆大戟也可作猫眼草入药，所以有人将乳浆大戟视为猫眼草。其味微苦，性平，对皮肤有刺激性和毒性[8]；具有利尿消肿，收敛止痒的作用。《湖南药物志》有治疗烧烫伤方。民间用药治疗肿胀和疣[9]；叶支敏采用乳浆大戟和鸡蛋结合食用来治疗癌肿及炎痛症[10]。

1.1 乳浆大戟提取物的抗肿瘤成分

乳浆大戟的化学成分较为复杂，主要为二萜类、黄酮类及其酯类等成分。乳浆大戟有很好的生物活性，有抗肿瘤、抗菌和抗白血病等多种作用[11]。王玉波等[12]已分离鉴定出3个二萜化合物即3，20-dibenzoyloxyingenol(1)，3，16-dibenzoyloxy-20-deoxyingenol(2)，3，13，16-tribenzoyloxy-20-deoxyingenol(3)，体外实验结果表明，化合物1为新二萜化合物，化合物2和3对Namalwa细胞均有较弱的细胞毒性。Whelan LC等[13]研究发现从乳浆大戟中提取的精油可以诱导肝癌细胞凋亡。1985年有学者发现大戟科、杉科、茜草科等植物中有抗肿瘤二萜[14]存在，从乳浆大戟分离得一抗白血病巨大戟二萜醇酯[15]。张文静[16]对猫眼草的某些单体化合物的生物活性初步进行研究，实验结果发现三萜24-亚甲基环阿尔廷醇(EL-12)对A549人肺癌细胞的抑制作用最强。猫眼草丹参水提取物能诱导小鼠肺癌细胞凋亡[17]。

1.2 乳浆大戟提取物作用于肺癌细胞

肺癌或称原发性支气管癌或原发性肺支气管癌，根据组织病变，肺癌可分为小细胞癌和非小细胞癌。肺癌可能是外因通过内因而发病的，外因可诱发细胞的恶性转化和不可逆的基因改变，包括原癌基因的活化、抑癌基因的失火、自反馈分泌环的活化和细胞凋亡的抑制。肺癌的发生是一个多阶段逐步演变的过程，涉及一系列基因改变，多种基因变化的积累才会引起细胞生长和分化的控制机制紊乱，使细胞生长失控而发生癌变。与肺癌发生关系较为密切的癌基因主要有HER家族、RAS基因家族、Myc基因家族等。相关的抑癌基因包括p53、Rb、p16基因等。与肺癌发生、发展相关的分子发病机制还包括生长因子信号转导通路激活、肿瘤血管生成、细胞凋亡障碍和免疫逃避等。

杨文杰等[18]用流式细胞术、MTT法分别观察乳浆大戟提取物检测对A549细胞凋亡率、细胞增殖抑制率的情况，实验结果初次发现乳浆大戟提取物可通过诱导A549细胞凋亡而抑制细胞增殖。在此基础上，王爱红等[19]进一步实验，并得出乳浆大戟提取物抑制A549细胞增殖是通过线粒体诱导A549细胞凋亡，可能的机制是上调bax和下调bcl-2的表达。乳浆大戟对肺癌的作用中仍未被发现的机制如p53、p16等抑癌基因是否起促进细胞凋亡的作用等亟有待于下一步的研究探讨。

2 乳浆大戟诱导人肺癌细胞凋亡可能发生的机制

2.1 相关调控分子对细胞凋亡的作用

研究发现一些凋亡相关基因，如bcl-2、c-myc、p53等，其中，bcl-2基因用于抑制细胞凋亡，而bax用于促进细胞凋亡，细胞凋亡由bcl-2和bax的相对活性决定[20]，此外，在一些肿瘤中，肿瘤细胞能够抵抗凋亡或诱导肿瘤特异淋巴细胞凋亡，Fas、FasL、Caspase-3在凋亡过程中起重要作用。肺癌细胞一个重要的生物学特性是细胞周期调控的失衡。细胞周期素D1(CyclinD1)及p16基因蛋白表达异常与肿瘤的发生密切相关。p53是在DNA损伤的情况下诱导细胞凋亡的关键因子，p53通过转录激活Bax表达，激活线粒体凋亡途径，也可以转录激活FasL及FAS蛋白表达。有研究发现，当细胞凋亡率和Bcl-2表示下降时，同时Fas表达明显上升，这可能是肺癌预后不良判断的标志之一，并表明Fas与Bcl-2蛋白负调控作用可能作用于肺癌的发生、发展[21]。姜山[22]研究发现含猫眼草的黄酮类粗提物兔血清对肺癌细胞株A549有明显抑制细胞增殖的作用，并且促进凋亡蛋白Casepase-9和Casepase-3蛋白切割，引起PARP蛋白活化，Bax表达升高，Bcl-2表达下降，从而阻滞细胞周期和诱导凋亡作用，最后实现抗肿瘤作用。

2.2 Casepase和Fas/FasL对肺癌细胞凋亡的作用

Caspase属于天冬氨酸特异性半肤氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡的启动和执行过程中起关键性作用。Caspase在细胞内通常以无活性的酶原形式存在，其内部特定的天冬氨酸残基部位的裂解加工可导致酶原激活，引发细胞凋亡。其中，Caspase 3可通过介导的死亡信号途径，被家族上游成员激活并水解为活性酶形式，进而裂解细胞的关键结构蛋白和看家蛋白，从而诱导细胞凋亡。张春玲等[23]构建了Lewis肺癌小鼠模型并观察到猫眼草水提物对小鼠Lewis肺癌有较好的抑瘤作用可能是通过上调Caspase 3的表达促发细胞凋亡。死亡受体介导的细胞凋亡是细胞凋亡的一条重要途径。Fas细胞表面受体，在许多细胞的凋亡中起关键作用[24]，Fas与其天然配体FasL结合可以触发凋亡的级联反应从而发生细胞凋亡。

2.3 其他可能诱发因素

郑中华等[25]研究表明H596细胞在高浓度的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)作用下能够诱发细胞凋亡，可能与TRAIL相关蛋白Caspase 8、Bcl-2和FADD蛋白的正常表达有关。Roker等[26]通过免疫组织化学方法对非小细胞肺癌的bag-1表达的研究发现约三分之二的肿瘤中bag-1表达均出现高水平的表达。EGFR在肺癌细胞中有表达或过度表达[27]，其过度表达引起下游信号转导失调，促进肺癌细胞增殖、新血管生成、粘附、侵袭和转移，从而抑制肿瘤细胞凋亡[28]。猫眼草活性部位可抑制EGFR的磷酸化，下调AKT和ERK信号，抑制肿瘤细胞的迁移[22]。吕丹[29]从中草药乳浆大戟中提取的精油能激活Casepase-3和Casepase-9的表达，下调Bcl-9/Bax的表达，可能是通过线粒体通路来诱导HeG2癌细胞凋亡；若将乳浆大戟提取物精油作用于肺癌细胞，那么诱导细胞凋亡的作用机理是否能通过线粒体途径有待于在接下来的实验中进一步验证。

3 小结

综上所述，乳浆大戟是天然的药物，其提取物及其有效成分的抗肿瘤作用[30]已有部分研究和报道。随着大戟科植物及二萜类等有效成分在分子生物学领域的研究，将可能会诱导肿瘤细胞凋亡进而用以治疗肿瘤的一个新方向。目前关于乳浆大戟与人肺癌细胞凋亡的关系只有部分文献报道过，但乳浆大戟如何产生抗肺癌机制有待进一步的深入实验，是否还存在除二萜类以外其它抗肺癌化学成分，这些都需要科学的设计实验去证明，在此希望可以引起一些研究者的注意，共同努力积极开展这方面的工作进而研究发现新的抗肺癌成分和机制为治疗提供新的靶点或方向。