激励电压对铜胁迫下水稻叶片电阻抗参数影响研究

王婧 殷华

摘 要：以不同浓度的铜离子胁迫作为基础，采用0.5v，1v，2v等3种激励电压研究对水稻叶片电阻抗测量结果的影响。结果表明，电阻抗测量结果与测量时激励电压的选择有密切关系：在低浓度短时间的铜胁迫后，0.5v激励电压所得阻抗结果与1v、2v激励电压所得结果差别较大;而在高浓度长时间胁迫后，三者差异并不明显。

关键词：水稻;电阻抗;激励电压;铜胁迫

中图分类号 S511.4+2文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）21-0023-04

Abstract：Rice is one of the most important food crops in China，and it is easy polluted by heavy metal because of the process of industrialization is speeded up. As a simple detection method，impedance parameters are widely used in the detection and estimation of plant heavy metal pollution. However，most of the researchers are limited to fit and calculate of the parameters，and ignored the influence of the excitation voltage on the measurement. This paper discussed on the influence of three excitation voltages （0.5v，1v and 2v） at copper ion stress environment. Results shows that selection of excitation voltage is related to the measurement results：after short period of copper stress at low concentrations，the impedance at 0.5v is quite different with 1v or 2v，nevertheless，there is no difference after long period stress with high concentration.

Key words：Rice;Impedance;Excitation voltage;CU stress

水稻是我国重要的粮食作物之一。据国家统计局相关数据显示，2018年全国稻谷播种面积约为3018.9万hm2，平均单产7.027t/hm2，总产21213万t。但是，近年来随着我国工业化程度的不断推进，水稻的种植环境正逐渐受到各种重金属元素的污染。铜作为一种与人类关系密切的有色金属，目前已经被广泛应用于机械制造、建筑工业、国防工业等领域。但过多的铜通过污水排放渗入到地下后，一定程度上增加了对水稻的污染机率。虽然有文献报道，少量的铜能促进水稻相关蛋白的分泌，有利于植物的生长发育[1];但相关研究已经证实，重金属对水稻的胁迫程度与其剂量有显著的相关性，若將水稻长期暴露在铜离子下，其产生的累积效应不但会带来毒性阻碍生长、对其DNA造成损伤，而且会通过直接或食物链的传递对人类的肝脏、肾脏健康造成损害[2]。因此，如何对水稻中累积的铜进行早期检测，及时发现和制止污染行为，对保证水稻安全，保障人们身体健康具有重要意义[4-6]。

传统的重金属元素含量检测通常以化学方法为主：在对检测区域的土壤或植物进行取样后，采用试剂分离的方法定量获取重金属的含量，这种方法虽然结果准确，但是过程较为繁琐，对实验者的操作水平及相关仪器设备依赖性较高;而另外一种更为常见的手段是通过观察植物在重金属环境下的生理、生化反应并构建模型，以此来得到其受到重金属污染的程度，包括近红外、LIBS光谱等。电阻抗图谱法是19世纪后期来发展起来的一种快速、非破坏性测定方法，其通过获取不同频率、电压下植物组织的电阻和电抗变化，结合等效电路模型来得到植物胞外电阻、胞内电阻等参数，并以此直接或间接反应生物细胞受到环境因素胁迫时的物理、化学变化。通过近30年的发展，电阻抗图谱法应用范围正逐渐扩展，从估计作物活力、营养状况到耐干旱、耐寒程度等都具有良好的表现，这为研究植物受环境因素胁迫的程度提供了依据[7-8]。但目前应用电阻抗图谱法来反应重金属对作物叶片的胁迫多集中于模型的确立与数据的拟合，其基本思路是分别测得作物的电阻和电抗，以电阻为实部、电抗为虚部作图得到电阻抗图谱的弧数和偏度，并以此确定究竟是使用集总模型还是分布模型，而后根据模型的等效电路表达，利用复最小二乘法进行拟合得到诸如弛豫时间、弛豫时间分布系数、细胞外电阻、细胞内电阻等参数。从中不难看出，为了得到准确的结果，电阻和电抗值的获取非常关键，但目前现有的研究大多只关心测量时的激励频率，对激励电压的选择讨论较少，而通常植物生理模型较为复杂，对激励电压的反应也各不相同，因此，当激励电压发生变化时，电阻抗的结果应该也有所不同。本试验通过分析在铜胁迫下水稻叶片电阻抗参数变化，探索激励电压的选择对电阻、电抗测量结果的影响，为准确选择激励电压、利用电阻抗参数来诊断水稻重金属污染程度提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本试验选取江西省水稻生产常用的品种金优458，在不同胁迫下进行叶片阻抗测量。试验场地为学校农学实验站，水稻种植采用桶培方式进行，培育桶为圆形红色塑料桶，高40cm。为了保持一致性，水稻培育周期中所用的全部土壤从同一地区获取，每桶装风干土10kg。土壤质地为中壤土，有机质19.46g/kg，碱解氮112.31mg/kg，速效磷11.65g/kg，速效钾123.84g/kg，全氮1.02g/kg，全磷0.48g/kg，全钾12.22g/kg，肥力中等。按25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg含量，分别向不同的桶中添加CuSO4·5H2O溶液进行铜胁迫处理，秧龄1个月左右，选择晴天进行移栽，每桶2穴，每穴3株，每种浓度的CuSO4·5H2O溶液各处理5桶。向每桶中施基肥N1.2g、P2O51.2g，K201.4g，栽培按常规管理方法进行，保证各个生长期处于合理的温、湿环境

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验采用完全随机设计，每次每组均剪取不少于6个样品，再随机选取3个样品进行测试。进入分蘖期后，每隔5d取不同组别的水稻叶片进行分析，测量电阻、电抗参数。

1.2.2 测量方法 样品电阻、电抗测量方法参考T.Repo的方法进行，避开水稻叶片的主茎剪取4mm×10mm大小的样本，分别在开路和短路条件下校正阻抗分析（TH2832），结束后开始测量样本在48个频率下（20Hz～200Hz）的电阻和电抗值。测量时，保持测量电极通过导电凝胶与水稻叶片良好接触，每个样本测量不少于10次，激励电压分别选取0.5v、1v和2v，以此来验证不同电压对阻抗的影响程度。水稻种植土壤、叶片等试验样品中铜的含量采用激光诱导击穿试验系统（libs）对试验土壤、不同铜浓度胁迫下的水稻叶片进行测试。根据式（1）所示的罗马金-赛伯公式，测量所得的光谱强度与元素含量有对应的关系，因此，通过观察激光诱导击穿光谱的强度，可以很好的得到待测元素的含量[11]：

1.2.3 试验仪器设备 试验所用LIBS系统采用ND-YAG脉冲激光器作为激发光源（VLITE-200型，北京镭宝光电技术有限公司），中心工作波长为1064nm，脉冲宽度6～8ns。激光反射处理后聚焦在待测样品表面。产生的激光等离子体光谱信号通过石英透镜耦合至光纤，最后再传输至光谱仪（AVASPEC-ULS2048-2，荷兰爱万提斯技术有限公司，波长210～473nm，分辨率0.08～0.16nm）完成光谱的分光与光电转换。为了确保结果的准确性，在测量前对对水稻叶片则采用自然风干处理。

1.2.4 数据处理 根据NIST数据库，对CU元素的鉴别常用324.75nm和327.39nm两根谱线进行，且通常324.75nm谱线约为327.39nm谱线强度的2倍。根据具体情况选用谱线作为铜元素含量的鉴别。如图1的土壤libs光谱曲线，由于其中的元素比较丰富，324.75nm谱线较易受Ti元素谱线324.86nm干扰而造成误判，因此对土壤中存在的CU元素判定通常以327.40nm为依据;叶片中由于元素种类较为单一，采用2根谱线进行判别[12-13]。

2 结果与分析

2.1 水稻叶片外观对铜胁迫的响应 由图2可见，在胁迫前，各试验桶中移栽的水稻叶片libs光谱数据并无显著差别。而在经过铜胁迫后，从外观上看，根据添加CuSO4·5H2O溶液的浓度不同，水稻叶片叶色、叶面积变化明显，特别是在200mg/kg浓度溶液的胁迫下，叶色出现变淡、叶面积变小等现象。为了明确水稻叶片中铜的富集程度，测量经过不同浓度铜胁迫后各水稻叶片的LIBS光谱数据。结果显示，经过胁迫后，水稻叶片中所累积的铜出现明显差异，而光谱数据中其它元素含量没有出现显著差别，故在此基础上对同样叶片进行电阻抗分析，其所得差异是铜元素导致。

2.2 相同浓度铜胁迫不同激励电压的影响 随着胁迫时间的推移，越来越多的铜离子将随着水稻根系的吸收进入叶片内部，继而引起其细胞发生变化，对阻抗产生一定的影响，图3是在25mg/kg浓度的铜溶液胁迫下，采用相同的激励电压5d、10d和15d后的阻抗变化曲线。由图3可见，在0.5v、1v、2v激励下阻抗都会随着时间的推移逐渐出现变化。以5d阻抗曲线为对照，在0.5v电压激励下，胁迫10d后的阻抗曲线峰值减少了21.3%，胁迫15d后的阻抗曲线峰值减少了了45.1%;在1v电压激励下，胁迫10d后的阻抗曲线峰值减少了51.4%，胁迫15d后的阻抗曲线峰值减少了64.2%;同样的情况在2v电压激励也出现，胁迫10d后的阻抗曲线峰值减少了54.5%，15d后的阻抗曲线峰值减少了63.2%。

各种浓度的铜溶液胁迫后采用不同电压激励的阻抗峰值响应结果变化见图4，由图4可以看出，在25mg/kg浓度的铜溶液胁迫下采用0.5V电压激励与阻抗峰值接近于线性关系，而若采用高激励电压，则在胁迫初期阻抗的变化会较大，但是随着时间的推移，这种变化趨于一致，并且不论是1v还是2v激励，阻抗峰值几乎一致。而在50mg/kg时3种激励电压的峰值逐渐靠近，呈现出一致性的趋势，表现为近似线性关系;但在高浓度的胁迫（大于100mg/kg）时，采用何种电压对阻抗峰值几乎没有影响，不同胁迫时间得到的阻抗峰值几乎相同，这说明此时选用何种激励电压进行阻抗测量对于高浓度的胁迫来说关系不大。

2.3 相同激励电压不同浓度铜胁迫的影响 有研究表明，铜离子的浓度会对水稻的品质造成影响[6]，当环境中出现过多的铜离子后，其会通过水稻根系吸收，最终沉淀在糠层、谷壳和精米中。因此，在相同的胁迫时间里，激励电压能否对铜离子胁迫的浓度进行表达，采用多少激励电压最有利于辨识出胁迫程度是值得研究的问题。在5d时间的胁迫后，采用0.5v激励电压时的阻抗曲线如图5（a）所示。由图5（a）可以看出，4种浓度的铜胁迫在0.5v激励电压下其阻抗峰值分别为74.4kΩ、62.7kΩ、41.2kΩ及39.8kΩ，同样以25mg/kg浓度作为对照，分别减少了15.7%、44.6%、46.5%。而在1v电压激励下，它们的阻抗峰值分别变化为97.95kΩ、48.14kΩ、37.1kΩ及38.2kΩ，相对于25mg/kg浓度时分别减少了50.8%、62.1%、61%。在2v电压激励下，这种情况再次出现，阻抗峰值分别变为了95.8kΩ、42.5kΩ、36.2kΩ及37.9kΩ，相对于参照的25mg/kg浓度，分别减少了55.6%、62.2%、60.4%。

不同铜浓度胁迫下激励电压对电阻抗峰值的影响结果见图6，由图6可以看出，当胁迫初期且浓度较低时，0.5v激励电压与1v、2v激励电压所产生的阻抗峰值具有明显差别，但当胁迫的浓度逐渐升高后，1v和2v激励电压所造成的阻抗峰值变化率较高;然而，当浓度超过100mg/kg后這种差异反而变得并不十分明显。图6（b）、（c）分别为胁迫10d、15d后，胁迫浓度与阻抗峰值的关系，在低浓度胁迫时，同样不论采用何种激励电压，其阻抗变化率较高，但当浓度超过100mg/kg后这种差异也十分微小，似乎水稻在吸收铜离子时出现了饱和效应，具体原因有待于后续研究揭示。

3 结论与讨论

试验结果表明，在相同的种植环境下，经过不同设计范围的铜离子胁迫后，水稻电阻抗参数会出现相应的变化，结果与实验时的激励电压、重金属胁迫浓度、胁迫时间均有一定的关系。在低浓度、短时间的铜胁迫下，采用0.5v激励电压所得到的电阻抗峰值曲线与采用1v、2v激励电压所得到的电阻抗峰值曲线有显著区别。而在高浓度的铜胁迫下，这种差异反而变得不太明显。当胁迫时间较短且胁迫浓度小100mg/kg时，0.5v激励电压得到的电阻抗峰值变化率较小，而在大于100mg/kg胁迫浓度的场合或胁迫时间较长后的阻抗测量则采用何种电压并无差异。因此，在低浓度的短时间的铜胁迫时，可以考虑采用低电压进行激励，而对于长时间高浓度的铜胁迫，采用何种电压激励所得阻抗结果相差不大。但具体是何种原因导致这种现象的发生，其它重金属元素是否也会导致出现类似的结论，还需通过试验进行深入分析。

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（责编：张宏民）