杀菌剂对几种果蔬采后病害生物测定试验方法的综述

摘 要：

杀菌剂的生物测定实验主要包括病原菌的采集、分离与提纯、离体培养及杀菌剂室内毒力测定。生长速率法、抑菌圈法、孢子萌发法等均是常用的杀菌剂室内毒力测定方法。本文概述了我国部分重要的果蔬采后病害的生物测定方法，并对未来果蔬采后病害的综合防治方法做出展望。

关键词：

果蔬;杀菌剂;采后病害;室内毒力测定

中图分类号：S482.2

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191130015

1 果树及蔬菜病原菌的采集、分离与纯化以及离体培养

1.1 病原物的采集

在笔者所查阅的文献中，研究人员采集果树及蔬菜病原菌的方法可大致分为从田间病样中采集培养和直接使用高校或科研院所保藏的菌株2类。从田间收集病样后，组织分离法是较为常见的采集方法。以西北地区常见的苹果腐烂病病菌（Cytospora spp.）为例，臧睿[1]等从陕西省不同的苹果产区，收集有苹果腐烂病的病枝，按常规组织块分离法采集病原菌，将各分离病原菌株接种离体枝条再从病部挑取繁殖体在PDA培养基上来纯培养病原菌。惠娜娜[2]等在研究苹果腐烂病菌时，从当地苹果园的病样上用组织分离法来采集病原菌，并进一步挑取菌落边缘的菌丝来进行分离纯化。该文献中对组织分离法有着详细的描述，组织分离法大致可分为从病健交界处切下小块，3%次氯酸钠溶液中消毒，70%酒精消毒，无菌水清洗，无菌滤纸自然晾干，PDA培养基培养5步。对于一些常用的菌株，一些科研机构一般会有所保藏，这样，科研工作者在研究时可以直接活化菌株后使用，省时省力，而且所用病原菌的纯度较高，可以节省后续分离纯化的步骤。王帅等在研究苹果腐烂病菌时，直接利用西北农林科技大学提供的苹果腐烂病菌菌株进行研究。

1.2 病原物的分离纯化

在笔者所查阅的文献中，平板划线法和稀释涂布法是较为常用的分离纯化方法，这2种方法中，又以平板划线法使用较多。以新疆地区的厚皮甜瓜采后病害为例，陈存坤等、毛晓英等、吴倩等在各自的研究中，均采用组织分离法采集病原菌，并进一步用平板划线法或稀释涂布法分离纯化。

1.3 病原物的离体培养

对于病原菌的离体培养，要根据所研究病原菌的生物学特性选用合适的培养基，常用的培养基有PDA培养基、PSA培养基等。

2 杀菌剂室内毒力测定方法的研究

杀菌剂室内毒力测定方法主要有生长速率法、抑菌圈法、孢子萌发法。在笔者所查阅的文献中，生长速率法、孢子萌发法是最为常用的杀菌剂室内毒力测定方法。其中，生长速率法与抑菌圈法侧重于研究杀菌剂对病原菌菌丝体生长的抑制作用，孢子萌发法侧重于研究杀菌剂对病原菌孢子萌发的抑制作用。生长速率法较抑菌圈法操作步骤少，故应用较多。

2.1 生長速率法

在笔者所查阅的文献当中，应用生长速率法的有5篇，涉及草莓灰霉病、洋葱黑霉及基腐病、西瓜枯萎病和番茄的某类采后病害。生长速率法的一般操作为用一定孔径的打孔器从活化的病原菌菌落边缘上打取菌块，分别接种到含或不含杀菌剂的平板中，培养一段时间后用十字交叉法垂直测量菌落直径并比较，计算生长抑制率。

草莓是我国重要的经济性水果，草莓灰霉病是草莓生产上重要的采后病害，其病原物为灰葡萄孢（Botrytis cinerea），杨敬辉等采用菌丝生长速率法测定了50%啶酰菌胺对草莓灰霉病菌的毒力，待对照中菌落快长满平皿时，采用十字交叉法量取菌落直径，并计算菌丝生长平均抑制率。Joon-Oh Kim等人测定了咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺、戊唑醇、苯吡唑胺、啶酰菌胺对灰葡萄孢的防治效果。在生长速率测定法中通过测量菌丝体在添加了杀菌剂与未添加杀菌剂的培养基中菌丝体的线性生长量，通过将添加了杀菌剂的PDA线性生长速率与未添加杀菌剂的PDA线性生长速率进行比较来确定生长抑制率。

洋葱的黑霉病由Aspergillus niger引起，基腐病由Fusarium oxysporum f.sp. cepae引起，这2种病害是在洋葱的储藏期造成巨大损失的病害，A.S. Futane等人利用生长速率测定法测定了10种杀菌剂对2种病原物菌丝体生长的抑制作用，并计算菌丝体生长的抑制百分比，进而找到对洋葱黑霉病、基腐病防治效果较好的杀菌剂。

Mark等人利用生长速率法测定二氧化氯气体熏蒸对Alternaria alternate、Stemphylium vesicarium的防治效果。Mark等所使用的是气体熏蒸作用的杀菌剂ClO2，首先气体熏蒸处理一段时间，后续操作同上。

许彦等采用生长速率法测定几种杀菌剂对西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）的室内毒力，所采用的生长速率法与上述相似。

2.2 抑菌圈法

在笔者所查阅的文献当中，应用抑菌圈法的较少，只有1篇。细交链孢菌（Alternaria alternata ）可引起梨黑斑病、草莓黑斑病等多种病害。崔娜等选取市面上常见的18种杀菌剂采用抑菌圈法对细交链孢菌进行室内抑菌效果测定。配制好分生孢子悬浮液，在培养皿中倒入纯琼脂培养基，冷凝后插入牛津杯。将配置好的分生孢子悬浮液与PDA培养基按一定的比例混合，取部分培养基倒入纯琼脂培养基上方制成平板，待培养基冷凝后拔出牛津杯，形成一个小圆孔，然后在小圆孔内加入杀菌剂，用十字交叉法测量抑菌圈边缘至小圆孔边缘的距离 （抑菌距离），用以评价供试菌对不同药剂的敏感性。

2.3 孢子萌发法

在笔者所查阅的文献当中，应用孢子萌发法的有5篇。在所查阅的文献中，孢子萌发法的基本操作相同，但在某些操作中又有区别，有的采用玻片法，有的采用悬滴法。

王帅等在研究生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌的室内活性评价时，测定了10种生物源杀菌剂对Valsa mali分生孢子萌发的抑制效果。操作可分为分生孢子悬浮液配制和玻片法2步。将杀菌剂与PDA培养基混匀，制成含药培养基，切取1cm2左右的含药培养基放置于载玻片上，滴入配制好的分生孢子悬浮液，涂抹均匀，培养一段时间后在普通光学显微镜下统计分生孢子的萌发情况并计算萌发抑制率。

Joon-Oh Kim等人采用室內毒力测定方法较为全面，包含生长速率法、孢子萌发法和杀菌剂对产孢抑制的作用3个方面。生长速率法在前面已讲，此处不再赘述。采用孢子萌发法做室内毒力测定，实验步骤与王帅等的相同，通过比较菌株在对照培养基和添加有杀菌剂的培养基上的分生孢子产生数量来测算产孢抑制率。

黄海等在进行番茄灰霉病菌室内毒力测定及药效试验时采用了孢子萌发法测定40%多菌灵（WP）、50%异菌脲（WP）和40%嘧霉胺（WP）对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用。其使用的方法与王帅等的略有不同，其使用无菌水来溶解药液，并使孢子悬浮液与不同浓度的药液混合，在吸取部分混合液滴到凹玻片上，测算孢子萌发抑制率。

赵新海等在研究康地蕾得对黄瓜枯萎病的室内生物活性测定时，采用孢子萌发法进行了康地蕾得对黄瓜枯萎病菌的室内毒力测定。实验主要包括孢子悬浮液配制与悬滴法测定孢子萌发率2步，但文献中并未对悬滴法做出比较详细的解释。

苹果黑星病的病原物为Venturia inaequalis，Umit Arslan研究硼酸、磷酸二氢钾、焦亚硫酸钠控制苹果黑星病的效用，采用孢子萌发法测试以上物质及戊唑醇与氟吡菌酰胺的混合药液的杀菌毒力，将孢子悬浮液加入到有土豆葡萄糖培养基（PDB）组织培养平板孔中，在培养基中分别添加上述杀菌物质，之后取试样在显微镜下培养观察，并统计孢子的萌发率。

3 展望

由于采后农产品的生理和生化变化，在收获后和储存期间新鲜农产品对采后疾病的敏感性增加，这有利于采后病原物的生长发展和采后疾病的发生，也是通过供应链造成损失的主要原因。目前，化学杀菌剂仍然是防治果蔬采后病害的有效手段。但是，病原物的抗药性和杀菌剂的残留问题正在促使研究者不断探索其他防治方法。本研究能为果蔬采后病害化学杀菌剂的合理使用打下牢固的基础，对果蔬采后病害的综合治理也具有借鉴意义。在未来的采后病害防治中，化学防治、生物防治、物理防治技术的探索以及综合使用将会不断发展。

参考文献

[1]臧睿，黄丽丽，康振生，王旭丽.陕西苹果树腐烂病菌（Cytospora spp.）不同分离株的生物学特性与致病性研究[J].植物病理学报，2007（04）：343-351.

[2]惠娜娜，郭建明，李继平，张大为，王立，郑果.6种杀菌剂对苹果树腐烂病菌的毒力测定及田间防治效果[J].中国果树，2018（06）：54-56.

作者简介：

张俊有（1968-），男，农艺师。研究方向：果树栽培、病虫防治、农产品质量安全。