解淀粉芽孢杆菌AF1对雏鸡益生性能和肠道菌群的影响

杨艳红，余 瑛，胡永强，唐 梦

(重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054)

芽孢杆菌属是一类在自然界分布广泛的、非常安全的、具有抑菌和调节免疫功能的重要微生物[1]，作为益生菌的一种，其因具有抗逆性强、营养需求低、复活率高、繁殖能力强等特有的生物特性而备受关注。

研究表明：芽孢杆菌益生菌胞外不仅能产生抑菌物质，抑制肠道病原菌生长，还能产生淀粉酶、蛋白酶等消化酶促进营养物质的吸收，因而能有效调节肠道微生态平衡且不会导致病原菌的耐药性[2,3]。本文分离到1株芽孢杆菌AF1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌[4]。初步研究发现，该菌株不仅能产生高活性酸性淀粉酶[4]和蛋白酶，还能产生抑制大肠杆菌、金葡菌、耐药大肠杆菌和耐药金葡菌等的抑菌活性物质[5]。通过研究AF1对pH、猪胆盐、人工肠液以及人工胃液的耐受性，发现其在pH 3.0～9.0范围内均可生长，并且对猪胆盐、人工胃液和人工肠液表现出很强的耐受能力[6]。本文旨研究AF1对雏鸡的安全、生长性能以及其对雏鸡肠道菌群的影响，为AF1应用于畜牧业提供一定实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

AF1，本实验室分离。

优菌肽(含有乳酸菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母等十多种益生菌，用于调节畜禽肠胃的活菌剂)，购自安徽申慧农业科技有限公司。

1.2 培养基和试剂

AF1生长培养基：马铃薯20%，蔗糖3%，蛋白胨2.5%，尿素0.33%，NaCl 1%， pH 7.0。

伊红美蓝琼脂培养基(ZMB)：购自杭州微生物试剂有限公司。

SS琼脂培养基：购自杭州百思生物技术有限公司。

Takara Minibest Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver3.0(Code No.9763)购自Takara(日本)。

RAPD PCR(含银染，含40个10bp随机引物)试剂盒(BTN101003)购自北京百奥莱博。

1.3 试验动物

1月龄体重相近的健康脱瘟土鸡苗120羽。

1.4 试验方法

选取120只健康脱瘟土鸡苗，随机分成3组，每组40只(公母各20只)。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2组为AF1益生菌组，饲喂基础日粮+AF1菌(含菌量：2.0×107cfu·g-1)；第3组为优菌肽组，饲喂基础日粮+优菌肽(含菌量：2.0×107cfu·g-1)。每天饲喂3次，保证足够的饲料，常规饲养40 d。采用玉米-基础日粮组成及营养水平参考我国现行肉用仔鸡配合饲料标准GB/T 5616—2008。

1.5 安全性指标测定

每天观察记录雏鸡的精神、食欲、行为、腹泻情况和死亡率。试验组停止喂加菌饲料3 d后，试验结束，从各组随机选取3只进行剖杀，检查记录脏器，尤其是消化道病变情况。

1.6 生产性能测定

试验期间每天按试验组分别记录饲料剩、给料量。试验开始时称取各组雏鸡质量，作为始重，实验结束后称取各组鸡的空腹质量，作为末重。最后计算平均日采食量(ADFI)、日增体质量(ADG)和料肉比(F/G)。

1.7 肠道病原菌测定

试验组停止喂加菌饲料3 d后，试验结束，从各组随机选取3只鸡进行剖杀，用剪刀纵向剪开盲肠，用无菌生理盐水冲去附在肠内壁上的食糜，然后刮取适量盲肠内壁物于定量无菌生理盐水中进行10倍梯度稀释，最后把不同稀释度样品分别涂布于伊红美蓝琼脂(ZMB)和SS琼脂平板，37 ℃培养24 h后计数，再乘以稀释倍数，计算获得每克样品所含活菌数(结果以对数均值log10cfu/g内容物表示)。

1.8 AF1对雏鸡盲肠中微生物菌群的影响

盲肠取样与菌增殖培养：AF1益生菌组停止饲喂加菌饲料3 d后，试验结束，从AF1益生菌组和空白对照组分别随机选取3只鸡进行剖杀，用剪刀纵向剪开盲肠，用无菌生理盐水冲去附在肠内壁上的食糜，分别刮取适量盲肠内壁物于AF1生长培养基中37 ℃，200 r/min培养20 h，然后12 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，收集菌体，作为每只鸡的肠道菌群样品，放置-80 ℃备用。另接种纯菌株AF1于生长培养基中37 ℃，200 r/min培养20 h，然后12 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，收集菌体放置-80 ℃备用。

DNA提取：分别取上述收集的菌体，严格按照Takara Minibest Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver3.0(Code No.9763)操作说明进行操作，获得各样品的总的DNA，放置-20 ℃备用。

AF1特异性引物筛选：从上述提取的DNA中随机选取空白对照组1只鸡的肠道菌群DNA以及纯菌株AF1的DNA为模板，RAPD体系及反应程序严格按照RAPD PCR(含银染)试剂盒(BTN101003，北京百奥莱博)的说明，选取40条10 kb随机引物(如表1)，分别进行PCR扩增，扩增产物采用5% PAGE凝胶电泳，然后分析电泳图筛选出AF1菌株的特异性引物。

表1 RAPD 引物序列

特异性引物PCR扩增：分别以上述所有样品的DNA为模板，把上述筛选的AF1菌株的每个特异性引物为引物进行PCR扩增，扩增产物采用5% PAGE凝胶电泳，分析统计AF1益生菌组鸡肠道菌的扩增产物与AF1单菌株扩增产物的相似度来确定AF1菌在鸡肠道中的定植情况。

1.9 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2007 进行试验数据整理，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，并采用LSD法进行组间多重比较，试验数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 AF1对土鸡的安全性能的影响

通过观察记录试验组与对照组饲养的鸡的精神状况、食欲、腹泻情况、死亡情况以及解剖脏器病变情况来评估AF1菌株对鸡的安全性能。由表2可知：AF1益生菌组的鸡明显比空白对照组和优菌肽组的鸡活跃，并且饲喂40 d后，AF1益生菌组没有腹泻鸡和死亡的鸡，存活率为100%，而空白组和优菌肽组均出现腹泻和死亡的鸡。从平均日采食量可知：3组鸡的食欲差异不显著(P>0.05)。通过解剖脏器观察发现，空白对照组和优菌肽组各有1只鸡的小肠出现红色斑点且盲肠偏小，而AF1益生菌组鸡的脾脏和胸腺偏大，其他器官正常，说明饲喂AF1菌以后，鸡的免疫力增强，生病率减少，存活率提高。

2.2 AF1对土鸡生长性能的影响

平均日采食量、日增体质量和料肉比等生长性能方面的指标是饲料利用率、经济性和生物添加剂效果显著与否的最直观的表现。由表3 可知：对于平均日采食量，与空白对照组相比，AF1益生菌组和优菌肽组均没有显著差异(P>0.05)。对于平均日增体质量，AF1益生菌组和优菌肽组显著高于空白对照组(P<0.05)，而它们两组之间差异不显著(P>0.05)。对于料肉比，空白对照组显著高于AF1益生菌组和优肽组(P<0.05)，而AF1益生菌组和优菌肽组之间无显著差异(P>0.05)。由此可见，AF1益生菌和购买的优菌肽在饲喂土鸡时可显著提高饲料转化率，降低饲料成本。

表2 AF1对土鸡的健康状况影响

指标空白对照组AF1益生菌组 优菌肽组精神状态++++食欲(平均日采食量)(ADFI,g·d-1)51.55±0.56a50.12±0.39a50.07±0.42a腹泻数4无3死亡数3无2存活率/%92.510095解剖脏器观察 1只小肠有红色斑点,盲肠偏小,其他器官正常2只脾脏和胸腺较大,其他器官正常 1只小肠有红色斑点,盲肠偏小,其他器官正常

注：“+”表示“一般”；“ ++”表示“较好”；数字右上侧不同字母为差异显著(P<0.05)；相同字母为差异不显著(P>0.05)。

表3 AF1对土鸡的生长性能的影响

注：数字右上侧不同字母为差异显著(P<0.05)，相同字母为差异不显著(P>0.05)。

2.3 AF1对土鸡肠道病原菌的影响

由表4可知：饲喂40 d后，AF1益生菌组和优菌肽组的大肠杆菌数明显比空白对照组少，并且差异极显著(P<0.01)。同时，在AF1益生菌组和优菌肽组的盲肠内未检出沙门氏菌，而空白对照组却明显检出沙门氏菌。可见，AF1益生菌和优菌肽都可以抑制肠道大肠杆菌和沙门氏菌的生长，尤其是对沙门氏菌效果更明显，从而可以减少鸡的肠道疾病发生。

表4 AF1对土鸡肠道病原菌的影响

注：数字右上侧不同大写字母为差异极显著(P<0.01)，相同大写字母为差异不显著(P>0.05)

2.4 AF1特异性引物筛选及PCR扩增

从40个10 bp随机引物中筛选出空白对照组鸡肠道菌群扩增条带与纯菌株AF1条带相同率小于50%或者没有相同条带的引物6个即A3、A5、B1、B6、B7和B10，又从中挑选出3个重复性好、条带清晰的引物为AF1的特异性引物即A3、A5和B6。然后用这3个引物，分别用所有AF1益生菌组肠道菌群、空白对照组肠道菌群和纯菌株AF1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果见图1～3。

1-纯菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌组鸡1,2,3；5,6,7-空白对照组鸡1,2,3

1-纯菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌组鸡1,2,3；5,6,7-空白对照组鸡1,2,3

1-纯菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌组鸡1,2,3；5,6,7-空白对照组鸡1,2,3

按照PAGE凝胶电泳图同一位置上DNA条带的有无进行统计，有带(包括弱带)记为“1”，无带记为“0”，计算各组实验中每只鸡肠道菌群的各个引物PCR扩增产物条带与纯菌株AF1扩增产物相同的条带的百分比P，即P=(NXY/NX)×100%，NXY是纯菌株AF1和鸡肠道菌群的PCR扩增产物中分子量大小相同的DNA条带数，NX是纯菌株AF1 的PCR扩增产物的DNA条带总数。经统计分析发现：对于引物A3(如图1和表5)，纯菌株AF1总共获得20条扩增条带，AF1益生菌组3只鸡分别有13、15和14个条带与纯菌株AF1相同，平均有70±5.0%的条带与纯菌株AF1相同，并且它们之间的相似度平均达到了90%以上，而空白组3只鸡之间的条带完全相同，它们的条带仅有6个条带与纯菌株AF1相同，平均只有30.0±0.0%的条带与纯菌株AF1相同。对于引物A5(如图2和表6)，纯菌株AF1总共获得25条扩增条带，AF1益生菌组3只鸡分别有15、16和16个条带与纯菌株AF1相同，平均有63±2.3%的条带与纯菌株AF1相同，而空白组3只鸡中除了第3只鸡有少许条带外，其余2只鸡没有扩增出任何条带。对于引物B6(如图3和表7)，纯菌株AF1总共获得14条扩增条带，AF1益生菌组3只鸡分别有7、11和10个条带与纯菌株AF1相同，平均有75.0±5.1%的条带与纯菌株AF1相同，而空白组3只鸡都没有扩增出任何条带。

表5 引物A3扩增条带比较

表6 引物A5扩增条带比较

表7 引物B6扩增条带比较

综上，从3条特异性引物的PCR扩增电泳图谱都可以看出，AF1益生菌组的3只鸡的条带相似度都达到了90%以上，空白对照组的3只鸡的带谱也几乎完全相同，并且2组之间的条带存在极显著差异。由此推断，AF1饲喂以后，对鸡的肠道菌群有极显著的影响，并且饲喂AF1后的3只鸡，用不同的特异性引物扩增后，其条带与纯菌株AF1的扩增条带有60%以上相同，提示经饲喂AF1菌以后，AF1菌株可能在鸡的盲肠内定植，需进一步做实验进行验证。

3 讨论

解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌属中与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在自然界中分布广泛，易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境；其代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力[7-8]。目前，对解淀粉芽孢杆菌研究主要集中在生防领域，用于植物病原真菌和细菌的防治[9-10]。

解淀粉芽孢杆菌除了可以产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多种胞酶外，还可以产生大量稳定性较强的低分子抗生素、抗菌多肽、抗菌脂肽和抗菌蛋白类抑菌物质[8]。因此，把解淀粉芽孢杆菌用于动物饲养，可以有多重功效，不仅可以利用多种酶系促进饲料的消化和吸收，还可以利用抗菌物质抑制肠道病原菌生长，同时利用其好氧性消化掉肠道氧气，为肠道的大部分厌氧益生菌提供有益的厌氧环境，促进肠道菌群的平衡和肠道健康。近年来，国内外对其益生性能进行了大量研究，在鱼、母猪、肉鸡的饲养中取得了不错的效果[8,11-14]。但是，解淀粉芽孢杆菌同样由于其来源的不同，饲喂效果差异很大，有些甚至没有任何效果[7,15]，再加上目前解淀粉芽孢杆菌作为益生菌饲喂动物的研究还处于初始阶段，进一步筛选和研究新的解淀粉芽孢杆菌作为动物益生菌是非常有必要的。

本文用于研究的解淀粉芽孢杆菌AF1不仅能产生高活性酸性淀粉酶[4]和蛋白酶，还能产生抑制大肠杆菌、金葡菌、耐药大肠杆菌和耐药金葡菌等的抑菌活性物质[5]。并且AF1对酸碱、猪胆盐、人工胃液和人工肠液表现出很强的耐受能力[6]。本文研究表明：解淀粉芽孢杆菌AF1饲喂1月龄脱瘟土鸡苗后，相对于空白组和优菌肽组，AF1益生菌组无一只腹泻鸡，存活率为100%。AF1益生菌组和优菌肽组平均日增重显著高于空白对照组(P<0.05)，而料重比显著低于空白对照组(P<0.05)。AF1益生菌组和优菌肽组的盲肠内大肠杆菌数明显比空白对照组少(P<0.01)，且未检出沙门氏菌。采用RAPD技术筛选AF1菌株的特异性引物并进行PCR扩增，AF1益生菌组停止饲喂加菌饲料 3 d后，3只鸡肠道菌群的DNA条带相似度达到90%以上，与纯菌株AF1的条带有60%以上相同，空白对照组3只鸡的带谱也几乎完全相同，但与纯菌株AF1的条带存在极显著差异。由此可见，单菌株解淀粉芽孢杆菌AF1不仅能定植于鸡肠道内影响肠道菌群，抑制病原菌生长，减少疾病发生，提高鸡存活率，还能显著提高鸡饲料转化率，促进鸡的生长。近年来，随着进一步深入研究，其作为食品防腐剂、饲料添加剂和抗生素替代益生菌的应用开发也不断受到重视[11,16-20]。作为益生菌直接添加到动物饲料中，除了无毒无害以外，必须还要具有以下功能：能定植动物肠道，平衡肠道菌群，促进肠道健康，增强机体免疫力，提高饲料消化率和吸收率，从而促进动物生长，降低饲喂成本[11]。最常见的益生菌主要包括乳酸菌属、酵母菌属和产孢子的芽孢杆菌属等[21]。但是由于来源和种属不同，各种益生菌的应用研究效果存在很大的差异，目前大部分益生菌产品都是以多种菌混合的复合制剂。而根据上述研究，单菌株解淀粉芽孢杆菌AF1作为益生菌饲喂鸡，不仅可以定植鸡的肠道，而且其饲喂效果达到市场购买的复合益生菌产品优菌肽，甚至某些指标更优于优菌肽。

可见，单菌株解淀粉芽孢杆菌AF1具有多功能的益生效果，作为动物益生菌的开发，它不仅可以解决目前市场复合益生菌制剂在加工、运输及保存过程中容易失活以及在动物肠道中不能有效定植等问题[22-23]，并且作为单菌株制剂进行生产，其生产工艺方法更简单、生产成本更低。

4 结论

1) 解淀粉芽孢杆菌AF1饲喂1月龄脱瘟土鸡苗40 d，鸡的存活率达到100%，比饲喂优菌肽组的鸡更好。

2) 通过对比AF1益生菌组、优菌肽组和空白对照组3组鸡的平均日采食量、日增体质量和料肉比，虽然3组鸡的平均日采食量之间差异不明显，但是AF1益生菌组和优菌肽组平均的日增体质量都显著高于空白对照组(P<0.05)，而料肉比显著低于空白对照组(P<0.05)，可见解淀粉芽孢杆菌AF1和优菌肽一样能显著提高鸡饲料转化率，降低饲料成本。

3) 刮取鸡盲肠内壁物检测病原菌，AF1益生菌组和优菌肽组的盲肠内大肠杆菌数明显比空白对照组少(P<0.01)，且未检出沙门氏菌，证明解淀粉芽孢杆菌AF1和优菌肽一样能抑制病原菌生长，减少疾病发生。

4) 采用RAPD技术筛选AF1菌株的特异性引物并进行PCR扩增，AF1益生菌组3只鸡肠道菌群的DNA条带相似度达到90%以上，与纯菌株AF1的条带有60%以上相同，空白对照组3只鸡的带谱也几乎完全相同，且2组之间的条带存在极显著差异，表明AF1菌在饲喂土鸡时很有可能定植在鸡肠道内影响肠道菌群，发挥益生作用。