不同产地薏苡仁多糖的单糖组成分析

王奎龙　曹岗　何帅滢

摘要  [目的]分析不同产地薏苡仁多糖的单糖组成。[方法]收集不同产地的薏苡仁，以水提醇沉的方法获得薏苡仁粗多糖，并采用苯酚-硫酸法对各样品中多糖的含量进行测定;进一步使用HPLC-UV法对酸水解后的薏苡仁多糖的单糖组成进行分析。[结果]研究建立了稳定可靠的薏苡仁单糖组成分析方法，发现薏苡仁多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成，其中葡萄糖所占比例最高，并初步分析了7种单糖的质量分数，发现不同产地的薏苡仁存在的差异较大。[结论]研究方法专属性强，可为薏苡仁药材的质量控制提供依据。

关键词  薏苡仁多糖;HPLC-UV;单糖组成

中图分类号  R284    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.053

Analysis of Monosaccharide Composition of Polysaccharides from Coix Seeds of Different Origins

WANG Kui-long，CAO Gang， HE Shuai-ying

（School of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou，Zhejiang 310053）

Abstract  [Objective]The research aimed to analyze the monosaccharide composition of polysaccharides from coix seeds of different origins.[Method]The crude polysaccharide of coix seed from different origins was obtained by water extraction and alcohol precipitation， and the content of polysaccharide in each sample was determined by phenol-sulfuric acid method. The monosaccharide composition of acid hydrolyzed coix seed polysaccharide was further analyzed by HPLC-UV method.[Result]A stable and reliable method for the analysis of monosaccharides in coix seed was established. It was found that the polysaccharides in coix seed consisted of mannose， rhamnose，glucuronic acid， galacturonic acid， glucose， galactose and arabinose. The proportion of glucose was the highest， and the mass fractions of seven monosaccharides were preliminarily analyzed. It was found that coix seed from different habitats had great differences.[Conclusion]The method is specific and can provide basis for quality control of coix seed.

Key words  Coix seed polysaccharide;HPLC-UV;Monosaccharide composition

基金项目  浙江省公益性应用计划项目（2017C33174）。

作者简介  王奎龙（1989—），男，江苏泰州人，助理研究员，博士，从事中药炮制与质量控制研究。*通信作者，研究员，博士，从事中药研究。

收稿日期  2019-09-02

薏苡仁为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen（Roman.）Stapf的干燥成熟种仁，具有利水渗湿、健脾止泻、解毒散结的功效，临床常用于水肿、脚气、小便不利、脾虚泄泻等病征[1-2]。现代研究表明薏苡仁中主要含有蛋白质、油脂、多糖三大类成分，其中薏苡仁多糖具有降低血糖[3]、提高免疫力[4]、抗肿瘤[5]等多种活性功能。但关于该类成分如何发挥其药效的作用机制研究目前仍不清楚，因而开展关于薏苡仁多糖中单糖组成分的分析，对于阐明薏苡仁多糖药效作用的物质基础以及相关产品的开发极为重要。

单糖组成分析是多糖结构解析中最基础、最重要的环节，由于结构的复杂性，多糖的单糖组成分析一般需要经过多糖的降解、单糖的结构修饰、单糖的分离检测三大步[6-8]。该研究通过优化工艺富集得到薏苡仁多糖，采用酸水解的方法得到单糖，经过衍生化后采用HPLC-UV的方法研究薏苡仁多糖的单糖组成，为薏苡仁物质基础研究及质量标准的制定提供借鉴。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  试材。

薏苡仁购自市场，经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen（Roman.）Stapf的干燥成熟种仁。三氟乙酸、氢氧化钠、甲醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、苯酚、硫酸及各单糖对照品均为分析純，乙腈、PBS缓冲液为色谱纯。

1.1.2  仪器。

Waters2695液相色谱仪（Waters）;Waters2849紫外检测器（Waters）;Empower色谱工作站;FW80-I高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;BOS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;BP211D电子天平（德国Sartorius公司）;UNIQUE-S15型RO-DI实验室纯水系统（锐思捷科学仪器有限公司）。

1.2  溶液的配制

2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液：取6.192 mL 99% TFA，超纯水定容至40 mL;单糖标准品溶液：取各单糖标准品2 mg，超纯水定容至1 mL，即2 mg/mL;混合标准品溶液：取每个单糖标准品10 mg，超纯水定容至5 mL，即2 mg/mL;0.3 mol/L NaOH 溶液：取0.12 g NaOH粉末，超纯水定容至10 mL;10%PMP甲醇溶液：取1.5 g PMP溶于15 mL甲醇中;0.3 mol/L HCI溶液：取浓盐酸0.3 mL，定容到12 mL。

1.3  多糖含量的测定

1.3.1  粗多糖的提取。

将薏苡仁粉碎后过三号筛，置于回流提取装置中，用10倍量的石油醚回流脱脂，过滤，弃滤液;滤渣加20倍量蒸馏水回流提取2 h，放冷后抽滤取上清液，滤液在9 000 r/min（20 ℃）条件下离心20 min，取上清液;向上清液中加入乙醇至80%，静置过夜后1 000 r/min离心10 min，沉淀加少量纯水溶解后，冻干得到白色粉末即为粗多糖，再用蒸馏水溶解后，制成供试品溶液，以备后用。

1.3.2  多糖含量的测定。采用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定，即在试管中加入1 mL蒸馏水、1 mL样品、1 mL 5%苯酚、5 mL硫酸，混合均匀，冰水浴冷却10 min，然后沸水浴加热15 min，结束后，在冰水浴中冷却10 min后，在490 nm波长下检测（对照品使用葡萄糖，配制浓度0、0.010、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL）。样品多糖含量=C×D×V/W×100%，式中，C为供试品测定浓度，D为稀释因素，V为供试品体积，W为样品质量。

1.4  单糖组成分析

1.4.1  多糖水解。

取10 mg左右薏苡仁多糖，溶于1.5 mL的2 mol/L TFA中，于安瓿瓶中充氮气封口，110 ℃干燥箱水解2 h;取出放冷后，若有不溶物，先离心（12 000 r/min，10 min），而后于60 ℃减压蒸干，并用约1 mL左右甲醇清洗，蒸干，重复3次，封口储存;于用前加1 mL超纯水复溶。

1.4.2  多糖的衍生化。

取单糖对照品混合溶液、单糖标准品溶液、样品、超纯水200 μL，加入200 μL的0.3 mol/L NaOH溶液，在加入400 μL的10%PMP甲醇溶液，加完后涡旋混匀，于70 ℃水浴45 min，冷却至室温，加入200 μL的0.3 mol/L的盐酸溶液，涡旋混匀，加入1 mL氯仿萃取，涡旋1 min，4 500 r/min离心5 min，然后再10 000 r/min离心5 min，取上清，重复3次，通过0.45 μm微孔滤膜过滤后HPLC进样分析。

1.4.3  HPLC分析。

流动相：乙腈（A）-PBS缓冲液（pH=6.9）（B），等度洗脱：A∶B=15∶85。體积流量1 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。

1.4.3.1  方法学考察。

线性关系：配制一系列2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 mg/mL的混标溶液，进样20 μL，以峰面积y对单糖浓度x做回归计算，制备标准曲线;精密度：将混合对照品衍生化溶液，分别进样20 μL，连续进样6次，计算7种单糖的RSD值;重复性：称取6份多糖样品，水解并衍生化后，根据液相条件下进入色谱分析，记录相应峰面积，计算RSD值;稳定性：精密吸取供试品溶液20 μL，分别记录0、1、2、3、4、8、12 h 的峰面积，计算RSD值。

1.4.3.2  样品测定。

称取薏苡仁多糖样品，分别按“1.4.1”“1.4.2”方法制备供试品溶液，进样测定;按标准曲线法计算样品中7种单糖的含量。

2  结果与分析

2.1  7批次样品多糖含量分析

由图1可知，在所选波长和葡萄糖浓度范围内，吸光度Y与葡萄糖浓度x呈现良好的线性关系，获得回归方程：y=3.784 5x+0.039 9（R2=1）。7批次薏苡仁样品多糖含量测定结果见表1，可知不同产地的薏苡仁含量差异较大，其中以20190101批次样品的薏苡仁多糖含量最高。

2.2  方法学考察

2.2.1  线性关系考察。

按“1.4.3.1”方法操作，结果见表1。从表1可看出，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖在线性范围内线性关系良好。

2.2.2  精密度考察。

按“1.4.3.1”方法操作，测得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD值分别为0.95%、0.55%、0.71%、0.79%、1.33%、0.16%、1.76%，表明精密度良好。

2.2.3  重复性考察。

按“1.4.1”“1.4.2”方法制备5份薏苡仁样品，吸取20 μL进样分析，记录相应的峰面积，计算RSD值，结果显示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD值分别为0.24%、1.25%、1.21%、0.38%、0.40%、0.71%、0.63%，表明重复性良好。

2.2.4  稳定性考察。

按“1.4.3.1”方法操作，，结果显示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD值分别为1.72%、1.76%、0.67%、1.23%、1.01%、0.62%、2.65%，表明稳定性良好。

2.2.5  7批次样品的单糖组成分析。

按标准曲线法方案测定7批次薏苡仁样品中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量百分比（占7种单糖的比例），结果见表2。由表2可知，薏苡仁样品中的葡萄糖含量均为最高，阿拉伯糖含量最低，不同产地的薏苡仁多糖在单糖组成上存在较大差异。含量测定的HPLC图谱见图2～3。

3  讨论与结论

多糖类成分是中药中的一大类成分，由于结构复杂、生物利用度差，在过去这类成分并不受重视，但随着研究的深入，科研工作者们发现这类成分也具有较好的生理活性作用。如枸杞多糖类成分具有较好的抗肿瘤活性作用，研究发现枸杞多糖对胰腺癌细胞bxpc-3、panc-1和aspc-1的增殖具有剂量依赖性，而对正常细胞hpde6-c7和lo2几乎没有细胞毒性，并且通过阻断MAPK信号通路和FAK/AKT/GSK-3β信号通路抑制bxpc-3细胞的侵袭作用，该研究从细胞分子水平证实了枸杞多糖的抗肿瘤活性作用，为枸杞多糖的进一步开发奠定了基础[9]。研究还显示多糖类成分能够与人体的肠道菌群产生相互作用，从而达到维持肠道内环境稳态、改善疾病状态的作用。如肉苁蓉多糖可以促进酪乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的生长，有利于人体肠道微生物群的形成[10]。

目前已发现薏苡仁多糖具有治疗糖尿病[11]、脾虚水湿不化[12-13]、腫瘤[14]等药理作用，但关于薏苡仁多糖结构的研究大多还停留在总多糖的含量测定方面[15-16]。该研究通过建立HPLC-UV的分析方法，对不同产地薏苡仁的单糖组成进行了初步分析，研究发现不同产地薏苡仁种单糖的组成差异较大。但关于单糖组成的差异与其药效之间是否存在关联性还需进一步的研究。

该研究中的方法学考察结果表明，该方法操作简单、测定结果准确、重复性好、精密度高，可用于薏苡仁单糖类成分的含量测定，可为薏苡仁物质基础研究、质量标准的制定以及道地性研究提供借鉴。

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