转基因产品CaMV 35S启动子基因实时荧光PCR检测方法中引物探针序列特征及影响

杨杰　李兰　戴莉　张江国　莫善明　徐新龙

摘要  [目的]分析不同标准方法中CaMV 35S启动子基因筛查方法中引物探针位置关系，讨论以引物探针序列重组为阳性对照样品的可行性。[方法]收集国内标准方法中CaMV 35S启动子基因检测引物探针序列与CaMV参考序列比较，确定其引物探针位置特点。设计不同长度间隔序列的串联引物探针重组序列，检测其结果差别。[结果]CaMV 35S启动子基因实时荧光PCR检测方法中引物与探针区间隔序列对扩增结果影响甚微。[结论]通过将引物探针序列顺序串联合成重组序列可以作为特定实时荧光PCR检测方法的阳性对照。

关键词  转基因;CaMV 35S启动子;实时荧光PCR;阳性样品

中图分类号  Q785    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0192-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.058

Characteristics and Effects of Primer Probe Sequences in Real-time Fluorescent PCR Detection Method for GMO Products CaMV 35S Promoter Gene

YANG Jie，LI Lan，DAI Li et al  （Technical Center of Alashankou Customs，Alashankou，Xinjiang 833418）

Abstract  [Objective]The research aimed to analyze the position relationship of primer probe in different standard methods for CaMV 35S promoter gene screening detection method，and discuss the feasibility of using primer probe sequence recombination as positive control sample.[Method]The primer and probe sequence of CaMV 35S promoter gene detection in domestic standard methods was compared with the CaMV genome reference sequence，to determine the position characteristics of the primer and probe.[Result]The interval sequence between primers and probes in real-time PCR detection of CaMV 35S promoter gene had little effect on amplification results.[Conclusion]By combining primer probe sequences into recombinant sequences，it can be used as a positive control for specific real-time PCR detection methods.

Key words  GMO;CaMV 35s promoter;Real-time fluorescent PCR;Positive control sample

基金项目  新疆维吾尔自治区国际合作项目（20166012）。

作者简介   杨杰（1986—），男，新疆乌鲁木齐人，助理工程师，从事转基因及微生物检测工作。*通信作者，高级农艺师，从事实验室管理及出入境植物检疫工作。

收稿日期  2019-06-04

随着基因工程技术在遗传育种方面相关的研究中不断加深，转基因作物開发日渐成熟，其在世界范围内的应用和种植越来越广泛，在国际农业发展和经济贸易过程中都起到了举足轻重的作用。根据国际农业生物技术应用服务组织（internarional service for the acquisition of afri-bio-tech applications，ISAAA）官方数据统计，截至2019年4月，全球各国总计批准了31个物种共计517个商业化转基因事件的加工或种植，并且这个数量每年仍有数以十计的数量在不断增长[1]。

在一个转化事件的开发过程中，插入基因片段的构建是工作的核心，插入片段大都是以一个或多个由启动子-目的基因-终止子构成的转录单元串联而成。目前在世界各国已经通过审批允许贸易、加工和种植的商业化转基因作物中，花椰菜花病毒（简称CaMV）35S启动子是使用最为成熟的外源启动子序列之一。完整的CaMV 35S启动子具有在多数植物及部分真菌中均能高效转录的特点，这使其能够被广泛应用于玉米、大豆、土豆等各种主要粮食及经济作物的基因工程改造工作中[2]，目前根据国际生物安全信息交换所（biosafety clearing-house，BCH）中的信息记录，插入基因片段的结构中涉及CaMV 35S启动子的转化事件已经多达368个[3]。

转基因技术不断发展的过程中，转基因作物及其加工产品的安全性一直是世界范围内关注的焦点。为了保障各个国家生态环保及社会政治经济等方面的需求，各国对转基因作物的种植贸易加工都有着不同程度的管理规定，而是否具备成熟的转基因成分检测标准方法体系就成为这些监管政策是否可以顺利实施的先决条件。由于CaMV 35S启动子基因在转基因技术中应用广泛的特点，通过对食品农产品中CaMV 35S启动子基因的筛查成为转基因产品检验方法中应用最为常用的手段，不同国家和地区对于转基因成分中CaMV 35S启动子基因筛查大多建立了国家、地区及行业标准[4]。

然而不同产品不同范围的检测标准方法中，CaMV 35S启动子的检测所采用的引物探针序列不尽相同。对于Taqman探针实时荧光PCR检测而言，其检测的特异性取决于引物探针序列，与引物探针结合区域之间的序列无关。该研究旨在通过对目前国内现行有效的13个不同对象转基因成分检测标准方法[5-17]中CaMV 35S启动子基因检测片段的序列特点进行分析，建立在人工合成引物及探针序列中插入不同长度间隔序列作为比较对象的模型，通过将这些不同长度的重组序列与阳性物质进行实时荧光PCR检测，比较引物与探针序列之间不同长度插入片段对实时荧光PCR检测结果是否产生明确影响，从而确定仅用引物及探针序列信息进行重组构建的序列作为特定转基因成分检测方法阳性对照模板的可行性。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  阳性物质。试验采用 2016年由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的粮食转基因检测能力验证计划（计划编号：ACAS-PT215）中检出的阳性转基因玉米粉作为阳性物质。

1.1.2  重组序列及引物、探针。试验所用重组序列片段、引物序列及水解探针均由北京鼎国生物技术有限公司合成。

1.1.3  主要试剂。植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;FastStart Essential DNA Probes Master预混液购自罗氏诊断产品（上海）有限公司;琼脂糖凝胶及DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.4  主要仪器。Roche LightCycler 96型实时荧光定量PCR仪，ABI 9700 型PCR仪。

1.2  方法

1.2.1  CaMV 35S启动子基因不同检测片段特征分析。

通过NCBI检索获得花椰菜花叶病毒全基因组参考序列（编号：NC_001497），使用DNAMAN软件分析对SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》、 GB/T 19495.4—2018 《转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法》、农业部1782号公告-3-2012 《转基因植物及其产品成分检测调控元件CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV 35S终止子定性PCR方法》等13个转基因检测标准中CaMV 35S启动子基因检测引物及探针序列与参考序列进行比对，确定每个检测片段在基因中的位置，从而分析不同标准检测方法中实时荧光PCR的上下游引物及探针之间的间隔序列的长度特征。

1.2.2  不同长度插入片段的CaMV 35S检测阳性重组序列设计与合成。根据比对结果，分别设计5条插入片段长度不同的阳性重组序列，序列信息详见表1。

1.2.3  阳性重组序列的荧光定量PCR检测。

阳性物质基因组的提取按照植物基因组DNA提取试剂盒DP305说明进行操作，将合成好的阳性重组序列梯度稀释，选择浓度为10-9μmol/L作为模板与阳性物质基因组一同检测。PCR反应体系及程序按照SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中要求进行配置。

2  结果与分析

2.1  CaMV 35S启动子基因检测引物探针结合序列的特点

13个检测标准中CaMV35S 启动子基因检测的上下游引物及探针序列信息如表2，由表2可见13个检测标准中共有3个检测片段的选择，分别将农业部1782号公告-3-2012等9个检测标准中位于参考序列7 249～7 322 bp的检测片段记为CaMV1，SN/T 1198—2013中位于参考序列7 191～7 385 bp 的检测片段为CaMV2，GB/T 19495.4—2018等3个标准中位于参考序列7 241～7 322 bp的检测片段标记为CaMV3。

经比对发现3条检测片段有如下特征：①3条检测片段上游引物与探针序列均在同链，下游引物在互補链;②3个检测片段区域范围有重合，CaMV1、CaMV3全长位于CaMV2上游引物与探针序列之间;③CaMV1上游较CaMV3短8 bp，且两者下游引物区相同;④CaMV1上游引物与探针序列间直接相连，无间隔序列;⑤CaMV2上游引物与探针序列间插入片段较长，达到138 bp;⑥CaMV2 探针序列3端与其下游引物3端有7个bp的碱基互补状况，即探针结合区与下游引物结合区的互补链有部分重合。序列特征情况参见图1。

由以上特征可以发现在扩增片段中荧光探针的位置选择条件较为宽泛，与同侧引物间最近可直接相连不插入间隔序列，与异侧引物影响更小甚至可以有部分重叠而不影响扩增结果。检测片段上引物与探针序列间隔序列对检测结果影响较小。因此在设计阳性重组序列时，设立了将SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》上游拼接下游重叠序列的重组片段和上下游引物与探针序列间分别间隔0、1、3、5 bp的共5组阳性重组序列，与阳性物质进行比较插入碱基对检测结果的影响。

2.2  重组序列CaMV 35S启动子实时荧光PCR检测结果

经检测，C、C0、C1、C3、C5不同插入片段的5条重组阳性与阳性物质中CaMV 35S启动子基因均能有效地扩增，无明显差异，扩增曲线见图2。

3  讨论

3.1  现行标准中CaMV 35S启动子基因检测方法可能存在的问题

比对过程中发现SN/T 2135—2008《蜂蜜中转基因成分检测方法 普通PCR方法和实时荧光PCR方法》CaMV 35S启动子基因实时荧光检测方法上游引物3端与荧光探针5端有一个重叠的碱基T，由于上游引物与探针均结合同侧链，重叠碱基两者结合时会发生竞争，降低扩增效率，但推测由于仅重叠一个碱基，对结果影响尚小。

[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.甜菜中转基因成分检测 普通PCR方法和实时荧光PCR方法：SN/T 3959—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.饲料中转基因植物成分PCR检测方法：SN/T 1201—2014[S].北京：中国标准出版社，2016.

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因成分检测 玉米检测方法：SN/T 1196—2018[S].北京：中国标准出版社，2018.

[12]中华人民共和国农业部.转基因植物及其产品成分检测调控元件CaMV35S启动子、FMV 35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV35S终止子定性PCR方法：農业部1782号公告-3—2012[S].北京：中国农业出版社，2012.

[13]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.蜂蜜中转基因成分检测方法 普通PCR方法和实时荧光PCR方法：SN/T 2135—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[14]国家市场监督管理总局，中国国家标准化管理委员会.转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法：GB/T 19495.4—2018[S].北京：中国标准出版社，2018.

[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法：SN/T 1204—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.

[16]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因成分检测 马铃薯检测方法：SN/T 1198—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

[17]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.油菜中转基因成分检测 普通PCR和实时荧光PCR方法：SN/T 1197—2016[S].北京：中国标准出版社，2018.

[18]GIULIETTI A，OVERBERGH L，VALCKX D，et al.An Overview of real-time quantitative PCR： Applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods，2001，25（4）：386-401.