响应曲面法优化鲜青花椒护色剂配方

芦星淼，缪钢，孙梅，朱毅

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.鲁甸县明德农业开发有限公司，云南昭通657000）

花椒（Zanthoxylum L.）可用于治疗各种疾病，如高血压、腹痛、腹泻、头痛、痢疾等，另外，也可用作滋补品、调味品和驱虫剂[1]。研究表明，花椒提取液中含有酚类、黄酮类、萜类、蒽醌类和皂苷类化合物[2]，可抑制桃褐腐病菌，并可诱导桃果实产生抗性[3]，体内和体外试验表明花椒和花椒叶提取物对Ⅱ型糖尿病及相关的并发症有显著的治疗价值[2]；从花椒中分离中的活性成分可通过直接作用于血管平滑肌诱导血管舒张[1]；花椒精油对疟原虫、嗜人按蚊和中华按蚊具有杀虫活性[4]，而且花椒精油对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠实验性结肠炎具有保护作用[5]；花椒的茎可能是天然抗氧化剂和抗骨质疏松症的良好来源[6]。

花椒根据颜色可分为青花椒和红花椒，但是青花椒的品质优于红花椒，青花椒中的麻味物质是红花椒的1.6 倍，挥发油含量是红花椒的2.4 倍[7]。鲜青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc）采摘后如果不及时处理极易发生褐变影响其经济价值和品质[8-9]，但是目前关于花椒的研究主要集中在花椒提取物的成分及活性方面，青花椒护色方面的研究主要有张晓宁[10]等用响应曲面法，以色差为响应值，得到鲜青花椒的最佳护色工艺为：550 mg/L 的硫酸铜，1 000 mg/L 的抗坏血酸，杀菌时间20 min；张甫生等[11]采用微波和护色剂结合的处理方式制得干制青花椒，最佳的处理方式为：微波功率462 W，时间60 s，载料量50 g 对青花椒处理，之后再用含有30%乙醇和0.40%的异抗坏血酸钠对花椒喷涂处理，室温阴干，制得的花椒色泽青绿。关于鲜青花椒护色剂复配的研究较少，且使用的护色剂含有Cu2+，而人体摄入过多的Cu2+会对机体产生不良影响[12]，所以开发一种对青花椒护色效果较好且不含有Cu2+的护色剂配方是很必要的。

有研究表明光照和酶是影响青花椒干燥变色的主要因素[12]，其本质是叶绿素在各种因素的影响下发生反应，最终导致青花椒褐变，叶绿素在酸性的条件下不稳定，中性或者弱碱性的环境对叶绿素具有保护作用[13-14]，所以选择碳酸钠作为护色剂。Zn2+、Cu2+、Mg2+均可和叶绿素发生反应生成更稳定的化合物[15]，Cu2+对叶绿素的护色效果明显[16]，但是Cu2+在体内积累会产生不良的影响，且硫酸铜不属于食品添加剂，已被禁止添加于食品中，Mg2+的效果不如Zn2+，故选择含有Zn2+的葡萄糖酸锌作为护色剂，另外葡萄糖酸锌还可以被用作营养补充剂[17]。抗坏血酸和柠檬酸是常用的抗氧化剂，可选择抗坏血酸和柠檬酸作为护色剂。

所以本研究选取碳酸钠、葡萄糖酸锌、抗坏血酸和柠檬酸4 种护色剂，以开发一种安全有效的护色剂复配配方，延缓或降低鲜青花椒的褐变度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜青花椒：由鲁甸县明德农业开发有限公司提供，7 月中旬采摘置于保温箱中4 ℃低温避光运输至实验室后去掉枝叶，挑选颗粒完整、颜色均匀青绿、无褐变的新鲜青花椒，4 ℃冰箱保存备用。

葡萄糖酸锌、抗坏血酸：北京奥博星生物科技有限责任公司；柠檬酸、碳酸钠、丙酮：国药集团化学试剂有限公司；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电热恒温干燥箱（HGZN-Ⅱ-270）：上海跃进医疗器械有限公司；紫外分光光度计（SP-2500）：上海光谱仪器有限公司；高速冷冻离心机（3H12RI）：湖南赫西仪器装备有限公司；分析天平（ME204102）：梅特勒.托利多仪器（上海）有限公司；电子天平（DT500E）：常熟市佳衡天平仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 护色剂及浓度的选择

单因素试验护色剂浓度选择见表1。

表1 单因素试验护色剂浓度选择Table 1 Concentration selection of color protective agent in single factor test

1.3.2 单因素试验

称取鲜青花椒10.0 g，浸泡于20 mL 不同浓度的上述护色剂中30 min，取出后平铺于50 ℃鼓风干燥箱中30 min，以蒸发表面的水分并钝化酶的活性；取出冷却至室温，置于塑料PE 自封袋中4 ℃冰箱避光保存，根据张晓宁等[10]对青花椒的处理，15 d 后测定鲜青花椒的褐变度和叶绿素含量。

1.3.3 Box-Beheken 试验

根据单因素试验结果，选取葡萄糖酸锌（A）、柠檬酸（B）、抗坏血酸（C）3 个对花椒褐变度影响显著的因素作为响应变量，变量的水平以-1、0、1 表示，以褐变度为响应值，利用软件Box-Beheken 中心组合设计三因素三水平的响应面试验。鲜青花椒护色剂配方优化的的Box-Beheken 试验设计如表2 所示。

表2 Box-Beheken 试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Beheken test

1.4 指标测定

1.4.1 叶绿素含量测定

采用分光光度法，根据胡秉芬等[18]的方法稍作修改，称取1.00 g 处理过的鲜青花椒样品，加入2.0 mL 80%丙酮迅速研磨至提取完全，用80%丙酮冲洗并定容至15.0 mL，摇匀；4 ℃，10 000 r/min 离心20 min 后过滤，滤液分别在645 nm 和663 nm 下测定吸光度，根据下式计算叶绿素含量（mg/g）。

式中：A645、A633分别是鲜青花椒提取液在645 nm、663 nm 下的吸光度；V 为提取液体积，mL；m 为青花椒鲜重，g。

1.4.2 褐变度测定

根据消光值法[19]，称取处理过的鲜青花椒1.00 g置于研钵中，加入2.0 mL 左右的蒸馏水迅速研磨，研磨充分后转移至15 mL 离心管中，用蒸馏水洗涤研钵，洗涤液一并转移至离心管中，定容至10 mL。于4 ℃，10 000 r/min 下离心20 min，过滤后取上清液在410 nm处测定其吸光值A410，褐变度以10×A410表示。

1.5 数据分析

单因素试验数据使用Excel 2010 处理，制作图表，进行单因素方差分析；Box-Beheken 试验数据用软件Design-Expert 8.0.6 分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同浓度护色剂处理对花椒褐变度的影响

探究不同浓度的抗坏血酸、柠檬酸、碳酸钠、葡萄糖酸锌对鲜青花椒褐变度的影响，结果如图1 所示。

由图1A 可知，随着抗坏血酸浓度的增加，鲜青花椒的褐变度呈现先降低再升高的趋势，当浓度达到0.60%后，不同浓度的抗坏血酸处理结果之间不显著，当浓度为0.80%时褐变度最低，与对照组相比褐变度降低56.44%；由图1B 可知，用不同浓度的柠檬酸处理鲜青花椒，鲜青花椒的褐变度随柠檬酸浓度的升高先降低再升高，低浓度的柠檬酸就会对鲜青花椒的褐变度产生显著性影响，褐变度最低时对应的柠檬酸浓度为0.50 %，此浓度处理可使鲜青花椒的褐变度降低50.68%；由图1C 可知，鲜青花椒的褐变度随碳酸钠浓度的升高先降低后升高，最佳的使用浓度为0.70%，在该浓度下，鲜青花椒的褐变度与对照组相比降低31.96 %；从图1D 可以看出，不同浓度的葡萄糖酸锌处理会影响鲜青花椒的褐变度，当浓度为0.07 %时，鲜青花椒的褐变度最低为9.46，与对照组相比降低31.89%。

对试验结果进行单因素显著性差异分析，研究不同护色剂对鲜青花椒褐变度的影响显著程度，结果表明：抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸锌对鲜青花椒褐变度的影响均达到显著水平（P＜0.05），碳酸钠对鲜青花椒褐变度的影响未达到显著性水平（P＞0.05）。故以褐变度为指标可选择抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸锌这3 种护色剂进行响应面试验设计。

2.1.2 不同浓度护色剂处理对鲜青花椒叶绿素含量的影响

采用分光光度法测定不同浓度的抗坏血酸、柠檬酸、碳酸钠、葡萄糖酸锌处理后的鲜青花椒的叶绿素含量，结果如图2 所示。

图2A 表明，鲜青花椒的总叶绿素含量随抗坏血酸浓度的增加先迅速升高，后升高速度变慢；在抗坏血酸的浓度为0.60%时，总叶绿素含量达到最大值0.26 mg/g，与对照组相比高44.44%；随后总叶绿素含量随抗坏血酸浓度的增加呈下降趋势；叶绿素a 含量和叶绿素b 含量随抗坏血酸浓度的变化趋势与总叶绿素含量基本相同。由图2B 可知，在柠檬酸的浓度小于0.30%时，鲜青花椒中的总叶绿素含量与柠檬酸的浓度呈正相关；在浓度为0.30%时，总叶绿素含量达到最大值0.21 mg/g，与对照组相比高16.67%；随后总叶绿素含量随柠檬酸浓度的增加呈缓慢下降趋势。图2C表明，鲜青花椒中的总叶绿素含量随碳酸钠浓度的增加呈先缓慢升高后缓慢下降的趋势，在碳酸钠的浓度为0.50 %时，鲜青花椒中的总叶绿素含量最高为0.23 mg/g，比对照组高27.78%，可能原因是叶绿素在酸性条件下不稳定，弱碱性的条件对叶绿素具有保护作用，随着碳酸钠浓度的增加，溶液的pH 值升高，从而失去对叶绿素的保护作用。图2D 结果显示，在葡萄糖酸锌的浓度低于0.07%时，鲜青花椒的总叶绿素含量随葡萄糖酸锌浓度的升高不断增加；葡萄糖酸锌的浓度为0.07%时总叶绿素含量最高；随后总叶绿素含量呈下降趋势。

图2 不同浓度护色剂处理对鲜青花椒叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of different concentration of Colour preservatives on chlorophyll content of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc

在图2 中，鲜青花椒中的叶绿素a 含量、叶绿素b含量与总叶绿素含量的变化趋势基本相同。对不同浓度的护色剂处理后，鲜青花椒的总叶绿素含量进行单因素显著性差异分析，结果表明，抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸锌对鲜青花椒中的总叶绿素含量的影响显著（P＜0.05），而碳酸钠对鲜青花椒的总叶绿素含量影响未达到显著水平（P＞0.05）。当以总叶绿素含量为检测指标时，可选择抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸锌这3 种护色剂设计响应面试验。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，选择葡萄糖酸锌（A）、柠檬酸（B）、抗坏血酸（C）这3 个对鲜青花椒的褐变度和绿叶素含量影响显著的护色剂作为自变量，以褐变度为响应值（Y），利用Design-Expert 8.0.6 软件设计三因素三水平的响应面试验，响应面的试验设计和结果如表3 所示。

表3 响应面试验设计和结果Table 3 Response surface test design and results

续表3 响应面试验设计和结果Continue table 3 Response surface test design and results

2.2.2 模型与方差分析

用Design-Expert8.0.6 软件对试验数据方差分析，结果如表4 所示。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance table

得到的各因素与响应值间的回归模型方程为：。模型的P 值为0.040 6，说明建立的回归模型显著；所建立回归模型的决定系数R2为0.837 1，说明鲜青花椒褐变度的实测值与预测值拟合较好，可用此模型来预测不同浓度的葡萄糖酸锌、柠檬酸、抗坏血酸对鲜青花椒褐变度的影响；模型中二次项C2对响应值的影响极显著（P＜0.01），而其他的项对响应值的影响并未达到显著水平，说明不同浓度的护色剂之间可能存在相互作用，并非单一的线性关系；各因素对响应值的影响可通过方差分析中的F 值评价，F 值越大，说明对响应值的影响越显著[20]，所以各护色剂对鲜青花椒褐变度的影响顺序为：柠檬酸＞葡萄糖酸锌＞抗坏血酸。

2.2.3 响应面分析

采用Design-Expert8.0.6 软件对试验结果进行多元回归分析，得到护色剂葡萄糖酸锌（A）、柠檬酸（B）、抗坏血酸（C）对鲜青花椒褐变度交互影响的响应面，如图3 所示。

图3 两因素交互影响鲜青花椒褐变度的等高线及响应面图Fig.3 Effect of two factors on browning degree of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc：contour line and response surface diagram

等高线是响应面水平方向的投影，反应的是各因素之间是否存在交互作用，等高线形状呈椭圆表示两因素对响应值的交互作用显著，等高线形状呈圆形则表示两因素对响应值的交互作用不显著[20]。图3b 中的响应面结果显示A 轴方向的坡度较B 轴平缓，说明柠檬酸对鲜青花椒褐变度的影响较葡萄糖酸锌大；图3d中的响应面果显示C 轴的坡度较A 轴平缓，说明葡萄糖酸锌对鲜青花椒褐变度的影响较抗坏血酸大；图3f中的响应面结果说明：与抗坏血酸相比，柠檬酸对鲜青花椒褐变度的影响更大。这个结果与方差分析的结果一致：护色剂对鲜青花椒褐变度的影响两两之间存在交互作用；各护色剂对鲜青花椒褐变度的影响顺序为：柠檬酸＞葡萄糖酸锌＞抗坏血酸。

经分析可知，使鲜青花椒褐变度最低的护色剂配方为：葡萄糖酸锌0.07 %，柠檬酸0.46 %，抗坏血酸0.69%，在此护色剂条件下，鲜青花椒的褐变度为5.88。

3 结论

单因素试验得到对鲜青花椒褐变度影响较大的3 种护色剂是抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸锌。响应面试验优化鲜青花椒的护色剂配方，得出3 种护色剂对鲜青花椒褐变度的影响顺序为：柠檬酸＞葡萄糖酸锌＞抗坏血酸；得到的最优护色剂配方为：葡萄糖酸锌0.07%，柠檬酸0.46%，抗坏血酸0.69%，在此护色剂条件下，鲜青花椒的褐变度为5.88，与放置相同时间不用护色剂处理的鲜青花椒相比降低6.00 左右，说明使用此护色剂配方可明显降低或延缓鲜青花椒的褐变度。此方法虽然可以有效的降低鲜青花椒的褐变，但是Cu2+在机体积累会产生毒害作用，另外GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中并未将硫酸铜规定为食品添加剂，而本研究得到的添加剂配方不含有硫酸铜，含有的抗坏血酸、葡萄糖酸锌一方面可以起到降低鲜青花椒褐变度的作用，另一方面也可作为营养补充剂，配方中的柠檬酸作为一种酸度调节剂，同时还有抗氧化的作用[21]，广泛用于各类食品中，和抗坏血酸具有协同作用。所以本研究得到的护色剂配方既可以显著降低鲜青花椒的褐变度，同时具有安全、易得、经济的特点，可为鲜青花椒的护色提供理论依据。