氨氮对河川沙塘鳢胚胎和仔鱼的急性毒性研究

刘国兴,郑 友,霍春林,史杨白,丁淑燕,郝 忱,魏万红

(1.扬州大学 动物科学与技术学院,江苏 扬州 225009;2.江苏省淡水水产研究所,江苏 南京 210017)

氨氮是水产养殖环境中最常见的污染物之一,其在水中主要以离子氨(NH4+)和非离子氨(NH3)两种形式存在,两者之间可以相互转化,处于动态平衡[1-2]。NH4+对鱼类的毒性较小,而NH3具有脂溶性,能穿透细胞膜,进而对鱼类产生较强的毒害作用[3]。在高密度集约化的鱼类育苗或养殖系统中,鱼类的卵膜、排泄物及残余饵料等有机物经氨化作用产生大量氨氮,影响鱼类的生长发育、呼吸代谢和免疫功能,甚至引起鱼类暴发性疾病,造成重大的经济损失[4-5]。

河川沙塘鳢(Odontobutispotamophila)隶属鲈形目、塘鳢科,俗称虎头鲨、慈姑呆子和塘鳢鱼等,是我国特有的一种小型经济鱼类,主要分布于长江中下游及沿江各支流、钱塘江水系和闽江水系,偶见于黄河水系[6]。该鱼味道鲜美、营养丰富,深受广大消费者的欢迎,已成为我国水产业极具发展潜力的特色养殖品种[7]。随着2014年江苏省淡水水产研究所率先攻克河川沙塘鳢苗种规模化繁育技术难关并创建了具有区域特色的虾蟹塘套养河川沙塘鳢高效养殖模式,江苏各地河川沙塘鳢的养殖规模不断扩大。

近年来,本项目组发现,由于在河川沙塘鳢苗种孵化和幼体培育的整个过程中,通常不换水或仅少量换水,因而水体中氨氮不断积累,其可能是影响河川沙塘鳢苗种孵化率与存活率，甚至是导致疾病发生的关键因素。目前,有关氨氮对河川沙塘鳢毒性作用的研究尚未见报道。因此,我们以河川沙塘鳢为试验材料,采用96 h半静水急性毒性测定方法,研究了不同浓度氨氮对河川沙塘鳢胚胎和仔鱼的毒性作用,旨在为河川沙塘鳢繁育实践中的水质管理提供科学依据,同时也为河川沙塘鳢毒理学研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用河川沙塘鳢亲鱼由江苏省淡水水产研究所扬中基地提供,挑选体表无损伤、体质健壮、性腺发育良好的个体作为试验亲鱼(雌、雄亲鱼各25尾),体长(107.03±4.45)mm,体质量(40.91±1.78)g,将它们饲养于育种车间的产卵缸中(3 m×1 m×0.6 m)。每日17:00～18:00按体质量的5%～8%足量投喂鲜活淡水糠虾,次日6:00吸污换水1/3。采用红外摄像自动记录系统,全程记录试验亲鱼的各种行为。当观察到试验亲鱼具明显的发情行为时,采取半干法人工授精,用黄泥浆脱黏。将受精卵置于充氧水中孵化,水温从自然温度逐渐升至25 ℃,并保持恒定。随机挑选形态完好、处于同一发育时期(体节期)的河川沙塘鳢胚胎用作试验胚胎，胚胎发育分期参照张君等的方法[8]。试验仔鱼为孵化出膜7日龄的河川沙塘鳢。

试验用水为经过曝气48 h的自来水,水温(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超过6 mg/L,氨氮浓度低于0.01 mg/L,自然光照。

试验药物NH4Cl(分析纯)经105 ℃烘干至恒重,准确称样后以试验用水配制成10 g/L的母液,在试验时按比例稀释至所需浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 氨氮对河川沙塘鳢胚胎的急性毒性试验 试验分为对照组和试验组：对照组仅用试验用水；根据预备试验结果,按照等对数间距设置试验组的氨氮浓度梯度,分别为40.00、63.40、100.48、159.24、252.38和400.00 mg/L。对照组和试验组各浓度梯度均设3个平行,共用21个培养皿(直径18 cm，高2 cm)。在每个培养皿中放入20枚试验胚胎,试验液为350 mL,水温控制在(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超过5 mg/L。每24 h更换1次试验液,更换量为100%。试验期间不充气,定时检查试验胚胎的发育和死亡情况,及时剔除死亡胚胎,准确记录24 h、48 h、72 h和96 h的死亡枚数。死亡胚胎的判断标准：胚胎被触动5 s,胚体无任何反应即定义为死亡[9]。

1.2.2 氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的急性毒性试验 根据预备试验确定的浓度区间,按照等对数间距设置6个试验浓度组,分别为10.00、15.16、22.97、34.82、52.78和80.00 mg/L,同时设1个对照组,对照组仅用试验用水。每组3个平行,共用21个玻璃烧杯(容积2000 mL)。在每个玻璃烧杯中放入10尾试验仔鱼,试验液为1000 mL,水温控制在(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超过5 mg/L。在试验前一天停食,在整个试验期间不投喂、不充气,每24 h更换1次试验液,更换量为100%。定时观察试验仔鱼的活动状况和死亡情况,及时捞出死亡仔鱼,准确记录24 h、48 h、72 h和96 h的死亡尾数。死亡仔鱼的判断标准：仔鱼被触动5 s,鱼体无任何反应即定义为死亡[9]。

1.3 数据处理

使用SPSS 22.0统计软件处理试验数据,采用直线内插法求出24 h、48 h、72 h和96 h氨氮的半致死浓度(LC50)。安全浓度(SC)的计算公式[10]:SC=0.1×96 h时的LC50。非离子氨的计算公式[11]:非离子氨浓度=氨氮浓度/[10(pKa-pH)+1],其中pKa=0.09018+2729.92/T(T为绝对温度,T=273+t℃)。

2 结果与分析

2.1 氨氮对河川沙塘鳢胚胎的急性毒性

氨氮对河川沙塘鳢胚胎的急性毒性试验结果如表1所示。在同一处理时间下,随着氨氮浓度的增加,河川沙塘鳢胚胎的死亡率逐渐上升。在同一氨氮浓度条件下,随着处理时间的延长,河川沙塘鳢胚胎的死亡率逐渐增加。对照组和氨氮浓度为40.00 mg/L时,河川沙塘鳢胚胎在96 h内未见死亡。当氨氮浓度为400.00 mg/L时,河川沙塘鳢胚胎在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率均为100%。

表1 氨氮对河川沙塘鳢胚胎急性毒性的试验结果

氨氮对河川沙塘鳢胚胎的半致死浓度及安全浓度结果如表2所示。采用直线内插法对表1中的数据进行分析,求出氨氮对河川沙塘鳢胚胎24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为153.02、139.20、123.59和98.13 mg/L,SC为9.81 mg/L;转化为非离子氨的LC50分别为8.13、7.40、6.57和5.21 mg/L,SC为0.52 mg/L。

表2 氨氮对河川沙塘鳢胚胎的半致死浓度及安全浓度

2.2 氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的急性毒性

氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的急性毒性试验结果如表3所示。对照组和氨氮浓度为10.00 mg/L时,河川沙塘鳢仔鱼在96 h内无死亡。随着氨氮浓度的增加,其对河川沙塘鳢仔鱼的毒害作用增强,其死亡率逐渐上升。在同一氨氮浓度条件下,随着处理时间的延长,河川沙塘鳢仔鱼的死亡率逐渐增加。当氨氮浓度为80.00 mg/L时,河川沙塘鳢仔鱼在72 h和96 h的死亡率均为100%。

氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的半致死浓度及安全浓度结果如表4所示。根据表3中的数据,建立24 h、48 h、72 h和96 h的氨氮浓度对数(x)与河川沙塘鳢仔鱼死亡率(y)间的直线回归方程,依据方程求出氨氮对河川沙塘鳢仔鱼24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为54.52、40.63、30.32和26.16 mg/L,SC为2.62 mg/L;转化为非离子氨的LC50分别为2.90、2.16、1.61和1.39 mg/L,SC为0.14 mg/L。

表3 氨氮对河川沙塘鳢仔鱼急性毒性的试验结果

表4 氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的半致死浓度及安全浓度

3 讨论

3.1 氨氮对河川沙塘鳢胚胎的急性毒性

在水产养殖环境中,氨氮特别容易达到毒性水平,并且作为一种限制因子影响鱼类的生长发育和健康水平[12]。有关氨氮对鱼类的毒性效应研究较多,但是对鱼类早期生活史阶段(尤其是鱼类胚胎期)的毒性效应研究较少[13]。Broderius等[14]研究发现,在pH值为6.60～8.68、氨浓度为0.236～0.865 mg/L条件下,小口黑鲈(MicropterusdolomieuiLacepede)胚胎至孵化出膜7 d期间仔鱼的存活率无明显变化。据Solbé和Shurben报道[15],在受精24 h内开始暴露试验,当非离子氨浓度为0.027 mg/L时,虹鳟(Salmogairdneri)受精卵的死亡率超过70%。Barimo和Walsh[16]的研究结果表明,总氨对海湾豹蟾鱼(Opsanusbeta)胚胎96 h的LC50为63.6 mmol/L。本试验结果表明,随着氨氮浓度的增加和处理时间的延长,河川沙塘鳢胚胎的死亡率均呈现上升趋势。氨氮对河川沙塘鳢胚胎96 h的LC50为98.13 mg/L,SC为9.81 mg/L;转化为非离子氨的LC50为5.21 mg/L,SC为0.52 mg/L。因此,在河川沙塘鳢苗种孵化过程中,由于死卵和卵膜等有机物分解导致孵化水体氨氮浓度升高,因而需要加强水质监测, 适时采取水质调控措施,确保孵化水体中氨氮浓度和非离子氨浓度不超过安全浓度,从而提高河川沙塘鳢苗种的孵化率和繁育成效。

3.2 氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的急性毒性

在本试验期间,对照组和氨氮浓度为10.00 mg/L时,河川沙塘鳢仔鱼在96 h内无死亡。随着氨氮浓度升高,仔鱼的中毒症状越发明显。在中毒初期,仔鱼表现为游动急促或上下窜跳,呼吸急促,时而出现痉挛症状。随着中毒时间的延长,鱼体向一侧倾斜或腹部向上,不能翻转至正常游泳姿态,游动乏力,呼吸频率降低。濒死时,体色变浅,呼吸微弱,游动无力,身体侧翻,失去逃避能力。死亡仔鱼鳃盖及口裂张开,鱼体僵直,沉入水底。

本试验结果表明,随着氨氮浓度的增加和处理时间的延长,氨氮对河川沙塘鳢仔鱼的毒害作用增强,其死亡率逐渐上升。氨氮对河川沙塘鳢仔鱼24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为54.52、40.63、30.32和26.16 mg/L,SC为2.62 mg/L;转化为非离子氨的LC50分别为2.90、2.16、1.61和1.39 mg/L,SC为0.14 mg/L。截至目前,国内外学者在氨氮/非离子氨对仔、稚、幼鱼的毒性效应方面开展了大量的研究工作,但由于非离子氨、LC50和SC计算方法以及试验条件(pH值、温度、溶解氧、试验用水和试验鱼的生长发育阶段等)各不相同,因此难以对不同学者的研究结果进行确切的比较[17]。因此,笔者选取了计算方法相同、试验条件相近的相关研究结果与本文研究结果进行比较。据鲁增辉等[17]报道,非离子氨对稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)幼鱼24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为3.00、2.79、2.31和2.06 mg/L,SC为0.21 mg/L。郝小凤等[18]研究发现,非离子氨对泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为3.40、2.92、2.51和2.22 mg/L,SC为0.22 mg/L。从上述试验结果可以看出,虽然同为底层鱼类,但河川沙塘鳢仔鱼对非离子氨的耐受能力弱于稀有鮈鲫和泥鳅,这可能是由于鱼类生活习性差异导致其对非离子氨的耐受性不同。

此外,本研究结果表明,河川沙塘鳢胚胎对氨氮和非离子氨的耐受能力明显强于仔鱼。已有研究表明,海湾豹蟾鱼(O.beta)[16]、稀有鮈鲫(G.rarus)[17]胚胎对氨的耐受性亦强于幼鱼或成鱼,这与本研究结果一致。据Barimo和Walsh[16]报道,氨氮能够渗透通过卵膜,卵膜可选择性地渗透氨/铵盐或通过新陈代谢将氨清除,从而减轻氨对胚胎的毒害作用。

综上所述,随着氨氮浓度的增加和处理时间的延长,河川沙塘鳢胚胎和仔鱼的死亡率逐渐升高。本研究获得了氨氮对河川沙塘鳢胚胎和仔鱼的急性毒性结果,发现河川沙塘鳢胚胎对氨氮的耐受能力强于仔鱼,本研究结果可为河川沙塘鳢繁育实践中的水质管理和毒理学研究提供科学依据。