文蛤多肽的制备及抗氧化活性的研究

袁尔东，沈佳奇，任娇艳

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510641）

文蛤（Meretrix meretrix L.），俗称花蛤、黄蛤、海蛤，属于软体动物门、帘蛤科、文蛤属，是我国四大养殖贝类之一[1-2]。文蛤营养丰富，并具有多种生物活性成分，包括抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂及降血压等[3]。其中，多肽被认为是文蛤的主要活性成分。研究者们从文蛤中分离得到各种活性肽，包括抗肺癌活性肽[4]、抗鼻咽癌活性糖肽[5]、护肝活性肽[6-8]，以及降血脂和降血糖活性肽等[9]。氧化应激是引起肿瘤、炎症、动脉粥样硬化、糖尿病、肝损伤等多种疾病的重要机制之一[10-13]。天然抗氧化肽可有效清除体内活性氧自由基，增加机体抗氧化活性，在抗疲劳、抗肿瘤、护肝等方面具有良好效果[14-15]。因此，本研究从抗氧化活性的角度出发，对文蛤多肽（Meretrix meretrix peptide，MMP）的酶解工艺及其抗氧化活性进行研究，与一般文蛤酶解不同，文蛤酶解前进行冻干处理，排除鲜文蛤因保存问题而导致的变质以及在冷冻过程中的褐变问题，防止不同时间文蛤的活性不一致带来的干扰。同时本文研究了文蛤多肽与抗氧化剂维生素C 之间的相互作用，为文蛤的深度开发和利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜文蛤：市售；碱性蛋白酶（alcalase，200 U /mg）、中性蛋白酶（neutrase，200 U/mg）、木瓜蛋白酶（papain，600 U/mg）、胰蛋白酶（trypsin，600 U/mg）、胃蛋白酶（pepsin，15 U/mg） 复合风味蛋白酶（flavourzyme，30 U/mg）：广州华琪生物科技有限公司；1，1-二苯基-2- 三 硝 基 苯 肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器设备

SHA-C 恒温水浴摇床：常州澳华仪器有限公司；SCIENTZ-10N 冷冻干燥机：宁波新芝生物科技有限公司；722-P 型紫外可见光分光光度计：上海现科分光仪器有限公司；H2050R 冷冻离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；JYL-C03V 豆浆机：九阳股份有限公司；HYP-308 消化炉、KDN-103F 自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工艺的优化

1.3.1.1 蛋白酶的筛选

新鲜文蛤取肉，匀浆后冻干保存备用。取文蛤冻干粉 5 g，按料液比 1 ∶15（g/mL）加水混匀，按加酶量0.5%的比例加入胰蛋白酶（Try）、碱性蛋白酶（Alc）、木瓜蛋白酶（Pap）、中性蛋白酶（Neu）、胃蛋白酶（Pep）或复合风味蛋白酶（Fla）等酶制剂，分别在其最适温度与pH 值下（Try：50℃，pH 8.0；Alc：50℃，pH 10.0；Pap：55℃，pH 6.0；Neu：45 ℃，pH 7.0，Pep：37 ℃，pH 2.0；Fla：55 ℃，pH 7.0）酶解6 h。酶解结束后，在95 ℃下灭酶15 min，冷却至 25 ℃，9 000 r/min 离心 10 min，取上清液，测定蛋白回收率与水解度[16]，优选酶解效果最好的酶。

1.3.1.2 料液比的优化

取文蛤冻干粉 5 g，按料液比为 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）分别加水混匀，加入优选后的酶解效果最佳的酶，固定加酶量和酶解时间，在酶的最适温度和pH 值条件下进行酶解。酶解结束后，95 ℃下灭酶15 min，冷却，离心，取上清液，测定蛋白回收率与水解度，确定最佳料液比。

1.3.1.3 加酶量的优化

取文蛤冻干粉5 g，按最佳料液比加入水，混匀。分别按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例加入蛋白酶，在最适温度和pH 值条件下酶解。酶解结束后，95 ℃下灭酶15 min，冷却，离心，取上清液，测定蛋白回收率与水解度，确定最佳加酶量。

1.3.1.4 酶解时间的优化

取文蛤冻干粉5 g，按最佳料液比和最佳加酶量，分别加入水和蛋白酶，在最适温度和pH 值条件下分别酶解 2、4、6、8、10 h。酶解结束后，95 ℃ 下灭酶 15 min，冷却，离心，取上清液，测定蛋白回收率与水解度，确定最佳酶解时间。

1.3.2 蛋白回收率的测定

采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，按下式计算蛋白质回收率（%）。

式中：m0为文蛤冻干粉的蛋白质量，g；m1为文蛤酶解液的蛋白含量，g。

1.3.3 水解度的测定

水解度采用甲醛滴定法测定[17]。称取m g MMP 样品于100 mL 烧杯中，加水至80 mL，用0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至pH 8.20，30 s 读数保持不变。然后，缓慢加入10 mL 甲醛溶液，继续用0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至pH 9.20，记录pH 8.20 滴至pH 9.20 时消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数记为V1。同时做空白试验（将样品换为去离子水），记录加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数记为V0。按下式计算水解度。

1.3.4 DPPH 自由基清除率的测定

分别吸取不同浓度的样品的乙醇溶液2 mL，加入2×10-4mol/L 的 DPPH 乙醇溶液 2 mL，摇匀后，在 25 ℃下，黑暗处放置30 min。以无水乙醇调零，测定517 nm处的吸光值A样品。同时，测定样品溶液2.0 mL 与乙醇2.0 mL 混合液在517 nm 处的吸光值A空白，再测定2.0 mL DPPH 溶液与2.0 mL 乙醇在517 nm 处的吸光值 A对照。按下式计算 DPPH 自由基清除率（%）[18]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A样品-A空白）/A对照]×100

1.3.5 总还原力的测定

准确吸取不同浓度样品溶液2.5 mL 于试管内，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲盐液（PBS，pH 6.6）和1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴保温20 min 后迅速冷却。然后，加入2.5 mL 10%醋酸溶液，混匀，3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，于700 nm 处测定其吸光度值，吸光值增加表示还原力增强[19]。

1.3.6 羟自由基清除率的测定

在比色管中分别加入0.5 mL 9.0 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、以及一定体积的MMP 溶液、0.5 mL 9.0 mmol/L Fe2+溶液、3.5 mL 蒸馏水、5.0 mL 88 mmol/L 的 H2O2溶液，摇匀后放置15 min，在510 nm 处测定吸光度，记为A1。用0.5 mL 蒸馏水代替Fe2+溶液，同样方法测得的吸光度记为A2。取0.5 mL 蒸馏水代替MMP 溶液，同样方法测得的吸光度记为A3。按下式计算样品溶液的羟自由基清除率[20]：

羟自由基清除率/%=100-100×（A1-A2）/A3

1.3.7 MMP 与维生素C 协同抗氧化作用的研究

将维生素C 与MMP 进行不同浓度比例的复配，使复配体系中维生素C 浓度为5 μg/mL，MMP 浓度分别为 0.02 mg/mL～0.5 mg/mL，于 37 ℃保温反应 30 min。分别检测单一维生素C 溶液、单一MMP 溶液以及两者复配体系的DPPH 自由基清除率，考察二者之间的协同抗氧化效应，确定具有最佳协同效应的浓度配比。在最佳浓度配比条件下，改变MMP 和维生素C 的浓度，考察其清除DPPH 自由基的协同效应。

1.3.8 统计分析

所有数据均独立平行测定3 次，数据结果以平均值±标准差形式表示，采用Graphpad prism 6.0 软件对数据进行方差分析并作图，不同字母代表p＜0.05 具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 文蛤酶解的最优工艺

不同种类蛋白酶酶解文蛤的效果见图1。

如图1 所示，对比不同种类蛋白酶酶解文蛤的效果可知，胰蛋白酶、复合风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液的蛋白回收率相对较高。其中，胰蛋白酶酶解液的水解度又显著高于其他蛋白酶（p＜0.05）。因此，确定胰蛋白酶为MMP 的最佳水解酶。

图2 所示为在胰蛋白酶添加量0.5 %、50 ℃、pH 8、酶解6 h 后，MMP 的蛋白回收率和水解度。

图1 不同种类蛋白酶酶解文蛤的效果Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis of Meretrix meretrix L.with different proteases

图2 不同料液比条件下MMP 的蛋白回收率与水解度Fig.2 Protein recovery and hydrolysis of MMP with different feed-liquid ratios

若料液比太低，蛋白没有充分溶解游离出来，导致没有足够量的蛋白质被蛋白酶水解。若料液比过高，体系中蛋白酶和底物蛋白均被过分稀释，蛋白酶与底物蛋白接触变少、作用减弱，从而导致蛋白回收率与水解度降低。如图2 所示，在料液比1 ∶15（g/mL）条件下，MMP 的蛋白回收率与水解度都达到最高。因此，选择最佳料液比为 1 ∶15（g/mL）。

不同加酶量下MMP 的蛋白回收率与水解度见图3。

图3 不同加酶量下MMP 的蛋白回收率与水解度Fig.3 Protein recovery and hydrolysis of MMP with different enzyme dosage

如图3 所示，MMP 的蛋白回收率与水解度随着加酶量的增加而增加。当加酶量达到0.6%以后，酶解液的蛋白质回收率和水解度都不再明显增加。因此，选择加酶量0.6%为文蛤酶解工艺的最佳加酶量。

不同酶解时间条件下MMP 的蛋白回收率与水解度见图4。

由图4 可知，随着酶解时间的增加，MMP 的蛋白回收率与水解度也逐渐上升。当酶解时间达到6 h 之后，其蛋白质回收率和水解度不再明显变化。因此，选择酶解时间6 h 为MMP 酶解工艺的最佳酶解时间。

因此，最终确定文蛤酶解工艺的最佳条件为，料液比为1 ∶15（g/mL），胰蛋白酶添加量为0.6%，酶解时间为6 h。在此工艺条件下，得到MMP 溶液的蛋白质回收率为93.55%，水解度为29.55%。

图4 不同酶解时间条件下MMP 的蛋白回收率与水解度Fig.4 Protein recovery and hydrolysis degree of MMP with different enzymatic hydrolysis time

2.2 MMP的抗氧化活性

MMP 的DPPH 自由基清除活性见图5。

图5 MMP 的DPPH 自由基清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of MMP

如图5 所示，随着MMP 浓度的增加，其DPPH 自由基清除率也随之升高。当多肽浓度达到1.0 mg/mL时，其对DPPH 自由基的清除率达到76.93%。MMP 清除DPPH 自由基的IC50值为0.56 mg/mL，说明MMP 具有较好的DPPH 自由基清除率活性。

MMP 的总还原力曲线见图6。

图6 MMP 的总还原力曲线Fig.6 Total reduction power curve of MMP

由图6 可知，MMP 的总还原力随着浓度的增加而升高。当MMP 浓度增加到4.0 mg/mL 以上时，其总还原力的上升幅度减缓。MMP 的羟自由基清除活性见图7。

图7 MMP 的羟自由基清除活性Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of MMP

如图7 所示，MMP 具有一定的羟自由基清除活性，且随MMP 浓度增加其羟自由基清除率活性也明显增加。当多肽浓度达到10 mg/mL 时，其对羟自由基的清除率达到66.09 %。MMP 清除羟自由基活性的IC50值为 7.26 mg/mL。

2.3 MMP与维生素C的协同抗氧化效应

MMP 与维生素C 清除DPPH 自由基的协同效应见图8。

如图8 所示，维生素 C 在 5 μg/mL 浓度条件下，对DPPH 自由基的清除率为6.67%。0.02 mg/mL～0.5 mg/mL的MMP 溶液对DPPH 自由基的清除率为3.33 %～47.17%。将二者进行复配之后，其清除DPPH 自由基活性显著高于二者单一活性的物理加和值（p＜0.05），表现出明显的协同增效效应。尤其在0.05 mg/mL 的MMP 与 5 μg/mL 的维生素 C 的协同效应最高，其复配体系的清除DPPH 自由基活性比二者单一活性的加和值提高了82%。说明，在MMP 与维生素C 复配比例（质量配比）为10 ∶1 时，其二者的协同效应为最高。

图8 MMP 与维生素C 清除DPPH 自由基的协同效应Fig.8 Synergistic effect of MMP and VC on scavenging DPPH free radicals

MMP-维生素 C 复合物（10 ∶1，质量比）对 DPPH自由基的清除效应见图9。

图9 MMP-维生素 C 复合物（10 ∶1，质量比）对 DPPH 自由基的清除效应Fig.9 Scavenging effect of MMP-VC complex（10 ∶1，mass ratio）on DPPH free radicals

将MMP 与维生素C 按照10 ∶1 质量比进行复配后，检测其在不同浓度下的清除DPPH 自由基活性。如图9 所示，随着MMP-维生素C 复合物浓度的增加，其对DPPH 自由基的清除率也明显增加。当复合物浓度提高到 0.15 mg/mL MMP 和 15 μg/mL 维生素 C 时，其对DPPH 自由基的清除率达到了68.36%。

因此，添加一定量的维生素C，可在一定程度上提高MMP 的抗氧化性能，而有助于扩展其应用范围，并为文蛤抗氧化多肽的综合利用提供一定的参考依据。

3 结论

1）以蛋白质回收率和水解度为指标，对文蛤酶解工艺进行优化，确定其最佳工艺条件为：料液比为1 ∶15（g/mL），胰蛋白酶添加量为 0.6%，酶解时间为 6 h。在该条件下，得到文蛤多肽的蛋白回收率为93.55%，水解度为29.55%。

2）MMP 具有一定的体外抗氧化活性。其清除DPPH 自由基活性、总还原力以及清除羟自由基活性，随浓度增加而明显增加。其中，MMP 清除DPPH 自由基活性的IC50值为0.56 mg/mL，清除羟自由基活性的IC50值为 7.26 mg/mL。

3）MMP 与维生素C 在清除DPPH 自由基作用方面表现出明显的协同增效作用。在二者质量配比为10 ∶1 时，其协同增效作用最佳。