对基因芯片技术快速检测水中常见致病菌相关思考

蒋鹏

摘要：本文首先采用试验的方式进行分析靶基因的扩增状况，其次对于靶基因进行讨论，最后针对基因芯片技术快速检测水中常见致病菌进行了总结。

关键词：基因芯片技术;快速检测;致病菌

1.材料与方法

1.1检验靶基因的扩增

通过以下几种方式进行检验靶基因的扩增：其一，待检样品为多年分离并保留的菌株，分别来自饮用水与地表水、游泳池谁以及各种生熟食品分离所获得。细菌复苏之后转接入平皿内进行培养，选择生长在固体培养基上的菌落，进行研磨与震荡，并且混入100 纯水中，进行煮沸10min，10000r.min-1离心1min，汲取清液（DNA提取液）留以待用[1]。

其二，需要选择多个PCR与引物增加的靶基因（引物沙门菌inva基因、引物志贺菌virA、细菌16S rDNA）。选择正链的方式进行增加产物，从而达到试验所需的效果。其中所需要的材料由军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。PCR反应为50 的PCR反应体制中，含有10×PCR缓冲液5 ，dNTP Mixture 200  mol· -1，TaKaRa Taq（5U·mL-1）0.02U· -1，都为TaKaRa商品。其中各个引物都为0.1 mol· -1，细菌DNA提取液2 。通过以上的试验的方式，从而获得靶基因的扩增的原因，从而有效的进行控制管理。

1.2基因芯片

在试验中，需要灵活地运用基因芯片技术进行合理有效的试验，我们通过试验结构，能够采用检验探针进行确定细菌的种类，点阵分布见图1。检验探针分为五种类型：（1）阳性与探针相匹配，其主要作用为反应杂交体制是否有效与作为扫描坐标，包含26号探针;（2）细菌属/种特异性探针，包含6～25号探针;（3）辨别革兰阴性（ -）与革兰阳性（ +）菌的探针;（4）细菌科特异性包含4号与5号探针和属共有探针;（5）能够全部真细菌进行价值较，用于检验全部真细菌，包含1号探针。结合五种类型的探针的杂交状况能够判断待检样品中存在的细菌类型。采用表面固定的寡核苷酸探针阵列与化学处理之后的显微镜载玻片组成的基因芯片。

1.3杂交检验

通过试验，我们能够了解到，取出产物1 与杂交液4 进行融合，加热5min之后，迅速存放在冰面上，5min之后取出，放置在在探针阵列区域之内，之后盖上盖玻片，在温度50℃之间进行杂交。之后分别选取洗脱液A（1XSSC +0.2% SDS），洗脱液B（0.1×SSC+0.2%SDS），洗脱液C（0.1XSSC）分别洗1min。选用ScanArray3000（GSI Lumonics）芯片阅读仪，设置PMT与Laser强度通常为80%，并且采用Imagene4.0软件针对结果进行详细的分析。在全面进行分离菌株的鉴定过程中，同时需要鉴定形态学。

试验结果讨论

选择多个引物在统一的条件下进行20株常见菌的靶基因的提升，提升之后需要在同一条件下进行杂交，通过有关的仪器进行扫描只会，获得它们两个自身的杂交图谱。与此同时，需要对于不同类型的细菌所体现的各种情况，并且根据杂交图谱，结合相关标准进行杂交图谱之间的对比，进行确定常见菌的类型。

图2与图3分别为1株沙门氏菌与铜绿假单胞菌的杂交图谱。与图1的基因芯片点阵分布相对比，能够了解图2中，除了36号（阳性对照）发生强杂交信号之外1、3、4/5好探针位置发生强的杂交信号点，能够断定样品为 -菌、肠道菌、真细菌、沙门细菌。与上文所述相同，图3中，不仅36号发出杂交信号，2/7/13号位置同时也发出了杂交信号，能够准确的对于常见菌进行确定。以此类推，对于分离的20余株菌进行了详细的基因芯片检测。非特异性杂交发出较若的杂交信号点，需要加强杂交以后，加深洗涤的强度，才能够完美的进行预防非特异性信号的产生。

对于20株分离菌株的基因芯片检验结果与常见生化检测结果进行做对比，结果见表1，其中，19株通过与基因芯片的杂交被检验出来，1株发生的杂交信号较弱以致凭借基因芯片不能够分辨菌的种类;结合鉴定的结果被视为菌株鉴定的最终结论，将基因芯片的鉴定结果与最终结论想对比，能够了解，除了第7号样品之外，基因芯片的鉴定较为准确，最终结论的符合率达到95%（19/20）[2]。

结论

综合上文所述，现代化免疫学技术与传统的微生物检验技术的角度来讲，集运芯片检测技术最大限度的体现出高通能量以及效率快的优点。一张芯片一次能够对水中可能出现的常见致病菌进行全方位、系统的监测与鉴定，并且操作简单、快速，针对一个未知的菌落，能够在4h以内完成菌的判断。为尽快确定鉴别与诊断常见致病菌提供了一定程度上的技术手段，为今后的卫生抽查工作给予了一定的帮助。

参考文献

[1]李君文，晁福寰，靳连群， 等.基因芯片技术快速检测水中常见致病菌[J].中华预防医学杂志，2002，36（4）：238.

[2]靳連群，李君文，晁福寰， 等.基因芯片检测肠道致病菌技术的建立和应用[J].中华传染病杂志，2004，22（1）：24-26.