肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制的研究进展

谭赛娟，彭华保，陈虹亮

(南华大学附属郴州市第一人民医院新生儿科，湖南 郴州 423000)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, Spn)为革兰阳性双球菌，是儿童鼻咽部常见的定值菌，属于条件致病菌。2012年，据WHO报道发达国家儿童鼻咽部肺炎链球菌携带率为27%，发展中国家最高超过85%[1]。婴幼儿、老年人及免疫缺陷者是Spn的易感人群。Spn常引起社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症等多种感染性疾病。自耐青霉素的Spn发现以来，耐β-内酰胺类药物的流行引起众多学者的关注。

近年来Spn不敏感率明显降低，但在临床中分离菌对常用抗菌药物的耐药率仍呈增长趋势。随着Spn对青霉素耐药性的提高，极大程度地影响了非青霉素β-内酰胺类抗生素的使用，从而使得对非青霉素β-内酰胺类抗生素耐药性逐渐升高。2013年美国疾控中心发表的报告显示常见的非青霉素β-内酰胺类抗生素对Spn的耐药率分别为：头孢菌素类：<1%～29.9%，其中头孢呋辛29.9%、头孢曲松11.7%、头孢洛林<1%；碳青霉烯类：亚胺培南：23.8%[2]。由此可见，Spn对β-内酰胺类抗生素耐药的增加已经严重危害人类健康。因此，本文从以下几个方面综述Spn对β-内酰胺类药物的耐药机制。

1 产β-内酰胺酶

β-内酰胺类抗生素最显著的结构特征是含有一个β-内酰胺环，该环由三个碳原子和一个氮原子组成，与一个噻唑烷环相连。β-内酰胺酶能够在抗生素作用于靶点之前水解β-内酰胺环中的酰胺键，从而使其结构发生改变，β-内酰胺类抗生素失去活性[3]。β-内酰胺酶广泛分布于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，根据氨基酸序列可分为：A、B、C和D四个大类，A、C和D类的活性位点是丝氨酸残基，称为丝氨酸β-内酰胺酶(Serine-β-lactamases, SBLs)；B类催化作用依赖一个或两个金属酶锌离子，因此称为金属-β-内酰胺酶(Metallo-β-lactamases, MBLs)。SBLs和MBLs是β-内酰胺酶的主要组成部分[4]。2009年，印度新德里首次报道金属β-内酰胺酶(New Delhi Metallo-β-lactamase, NDM)几乎可以灭活所有β-内酰胺类抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素及临床上可用的β-内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦[5]，2016年，Chang等人[3]在Spn中分离出一株链球菌含有L-抗坏血酸6-磷酸乳糖酶，该蛋白酶具有金属-β-内酰胺酶活性。在Spn中至今还未发现NDM，但不能否认其存在的可能性。研究报道，编码β-内酰胺酶的基因主要有TEM，基因型有TEM-129和TEM-1，这些基因不仅可以通过染色体介导，还能由质粒介导传播[5]。由此可见，β-内酰胺酶在细菌之间易相互传播，导致微生物对β-内酰胺类抗生素广泛耐药。在世界范围内，产β-内酰胺酶菌株的发病率呈快速上升趋势。现已知的抑制SBLs主要有克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦和阿维巴坦，但还没有批准使用的MBLs抑制剂[6]，故超级耐药细菌一般是产MBLs的细菌[7]。

2 基因位点突变

2.1 青霉素结合蛋白基因位点突变

青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins, PBPs)是位于细菌细胞膜上的膜蛋白，能与青霉素共价结合而被称为青霉素结合蛋白。PBPs是一类参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成最重要的酶，包括转肽酶、羧肽酶、内肽酶。PBPs是细菌保持正常形态及功能的必需条件，PBPs的数量、种类或与抗生素的亲和力发生变化时，会影响细菌的细胞形态及其对抗生素的敏感性。

Spn共有6种PBPs，分别为PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b和PBP3，是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。β-内酰胺类抗生素通过β-内酰胺环中的羧基竞争性地与Spn细胞壁上PBPs中的丝氨酸羟基共价结合形成丝氨酸脂，使Spn细胞壁肽聚糖合成相关酶缺乏，从而干扰细菌细胞壁的合成，改变细胞壁的通透性，导致细菌细胞肿胀、变形，最后死亡，达到杀灭细菌的作用[8]。Spn细胞壁上的PBPs基因发生突变时，β-内酰胺类抗生素与PBPs的亲和力明显降低，两者之间不能共价结合，导致Spn对β-内酰胺类抗生素耐药。Spn对β-内酰胺类抗生素耐药，主要与PBP2x、PBP1a、PBP2b基因突变有关，一般单独的PBPs基因突变只会导致低水平耐药，PBP2x、PBP2b基因突变是β-内酰胺类抗生素耐药最常见的类型，PBP1a基因突变可导致高水平耐药。2018年，Diawara I等[9]发现PBPs序列的多样性程度与β-内酰胺类抗生素耐药性的增加呈正相关。此外，Fiher等[10]发现某些革兰氏阳性球菌，如肺炎链球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌等，它们的细胞壁肽聚糖结构相似，且体外能够在功能上交换肽聚糖生物合成途径，选择不同的PBPs机制以获得对β-内酰胺类抗生素耐药，使得细菌之间对β-内酰胺类抗生素耐药性相互影响。

2.2 非青霉素结合蛋白基因位点突变

非青霉素结合蛋白基因主要包括MurMN、PdgA(肽聚糖GlcNAc脱乙酰基酶)、CpoA(糖基转移酶)、CiaH(组氨酸蛋白激酶)基因。Filipe SP等[11]研究发现，MurMN基因编码的NurM和MurN蛋白可调控肺炎球菌肽聚糖中支链muropeptides的合成，其活性决定支链muropeptides的数量，MurMN在青霉素耐药Spn中的过度表达保护细菌免受青霉素的杀菌作用，使细胞耐受青霉素，对青霉素耐药。MurMN基因突变对β-内酰胺类抗生素产生耐药，需要与其他基因形成联合机制才能发挥作用。Schweizer I等[12]研究发现，MurM基因突变后会编码一种参与合成支链肽聚糖的转移酶，使Spn对β-内酰胺类抗生素产生高水平的耐药。PdgA、CpoA基因突变也与Spn对β-内酰胺类抗生素耐药相关，但其作用机制尚不清楚。CiaH基因突变后，对各种细胞壁抑制剂所致的早、晚期细胞溶解具有较好的抵抗作用，因此，可认为肺炎链球菌CiaH基因突变对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，该突变常出现在实验室突变株中，在临床株中较为少见。

3 共生链球菌

共生链球菌是指定植于人类口腔、皮肤、肠道和上呼吸道等的共生微生物群，常见的类型有Spn、米氏链球菌(S.mitis)、口腔链球菌(S.oralis)。研究发现β-内酰胺类抗生素耐药相关的链球菌是Spn对β-内酰胺抗生素耐药的基因储存库[13]。β-内酰胺类抗生素耐药相关的几种氨基酸改变，在其他共生链球菌中也发生了相应的改变，共生链球菌B6是种高水平的β-内酰胺类抗生素耐药和多重耐药菌株，其染色体编码2100多个基因，与细菌耐药机制密切相关。Spn和共生链球菌的耐药性进化主要涉及两个步骤：第一，选择PBP基因点突变的抗药性共生链球菌；第二，通过同源重组将这些抗性基因的一部分转移到合适的Spn，这与通常从米氏链球菌和口腔链球菌到Spn的基因单向转移是一致的[14]。MurE基因是从口腔链球菌到Spn对β-内酰胺类抗生素耐药性转移的决定因素[15]，产生耐药链球菌的绝大多数基因，在米氏链球菌中可以被证实[16]。Shelyakin PV等[17]认为，链球菌属的成员具有高度动态、开放的全基因组，这可能赋予它们抗生素耐药传播的能力。

4 自溶素浓度、活性的降低

自溶素(Autolysin, Lyt)是细菌自身产生的可降解细菌细胞壁的内源性蛋白水解酶，也称细胞壁水解酶，主要参与细菌自溶、自相残杀和青霉素诱导的溶解，常见的细胞壁水解酶有：LytA、LytB、LytC和磷酰胆碱酯酶。Kim GL等[18]发现Spn在生长进入稳定期后能观测到大量细菌自溶。LytA，即N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶，是一种重要的毒力因子，在Spn使用β-内酰胺类抗生素后的细菌溶解中起基础生物学作用，也是Spn所特有、自溶活性最强、研究较为深入的一种自溶素，它是通过特异性作用于N-乙酰胞壁酸和肽桥之间的酰胺键，导致细胞壁肽聚糖骨架断裂，使细胞壁坍塌，最终导致细胞溶解死亡。Mitchell LS等[19]报道LytA活性降低会导致Spn对β-内酰胺类抗生素产生耐药。Kietzman CC等[20]也发现当抗菌药物存在时，LytA通过快速清除Spn的荚膜，避免抗菌药物的杀伤作用，其浓度、活性都影响抗菌药物对Spn的杀伤效果，由此可见，LytA与β-内酰胺类抗生素耐药有关。

5 StkP基因的缺失或StkP磷酸化

StkP，即丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine protein Kinase)，由Spn的StkP基因编码，StkP蛋白由一个N端激酶结构域和一个C-末端四个青霉素结合蛋白与丝氨酸/苏氨酸激酶连接区结构(Penicillin-binding protein and Ser/Thr kinase-associated, PASTA)构成，是调控Spn基因表达的重要信号转导元件，在细菌细胞毒力、细胞壁合成、细胞生长和细胞分裂中发挥重要的调控作用[21]。StkP和PhpP(蛋白磷酸酶)是一对信号偶联物，PhpP可以调节StkP活性，也可以特异性地对StkP底物进行去磷酸化[22]。StkP作用靶点是参与肽聚糖生物合成第一步的磷酸葡萄糖胺变位酶GlmM，Dias R等[23]首先发现StkP与PBP突变无关的青霉素耐药有关。Huang YY等[24]证实β-内酰胺类抗生素可作为环境信号分子，肺炎链球菌StkP是感知β-内酰胺类抗生素的信号传感激酶，具有识别并结合β-内酰胺类抗生素的能力，当StkP基因敲除后，该Spn对β-内酰胺类抗生素高度耐药。此外，其课题组还发现当肺炎链球菌的phpP基因敲除后，使得肺炎链球菌的StkP磷酸化，也会产生与PbPs无关的β-内酰胺类抗生素高水平耐药。

6 耐药基因传递

耐药基因传递包括水平基因传递和垂直基因传递，水平基因传递指遗传物质通过受精以外的过程在生物有机体基因组中的传递；垂直基因传递则指DNA从母体到后代的传递。有研究发现，由于选择压力导致不同Spn菌株之间或Spn与其他定植微生物之间可以发生β-内酰胺类抗生素耐药基因的水平传递[25]。细菌之间的基因传递主要是通过质粒介导，直接转移至另一种细菌，许多质粒较大，可容纳多种耐药基因，是耐药基因转移的理想载体[26]。迄今为止，最大的Spn基因组序列的研究也证实基因重组与抗生素耐药性之间存在关联，使得新产生的肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性增强。质粒、噬菌体、外源性DNA是基因水平传递的三个主要驱动因子。水平基因传递主要有三种机制：(1)结合：基因通过可移动基因元件(MGE)编码结合菌毛运动，介导与受体细胞的相互作用。(2)转导：基因以噬菌体为媒介转入受体菌内。(3)转化：即通过同源重组将外源DNA导入基因组[27]。抗生素耐药基因的动员是水平转移的第一步，也是最重要的一步[28]。Wang Q等[29]研究发现，铜、镉、铅、锌四种重金属对质粒介导的抗生素耐药基因结合转移有促进作用。粪便污染、动物滥用抗生素与人类产生抗生素耐药密切相关，近年来，治疗动物疾病时滥用抗生素的问题越来越严重，Toth AG等[30]指出在动物体内也存在β-内酰胺类抗生素等耐药基因，这些基因可以通过质粒或染色体介导的方式通过水平或垂直在动物与动物、动物与人之间传播。

7 小结与展望

细菌对抗生素的耐药是多种耐药机制共同作用的结果，与抗生素的使用密切相关。明确Spn对β-内酰胺类抗生素的耐药机制，可以更好的指导临床合理、规范地使用抗生素，同时为更有效、更有选择性、更有针对性的新型抗生素以及酶抑制剂的研发提供理论依据。众多研究报道，PBPs基因突变是至今研究较为深入的Spn耐药机制之一，对产β-内酰胺酶Spn研究也越来越引起国内外学者的高度关注，SBLs抑制剂已较为成熟地运用于临床，近几年发现环硼酸盐对MBLs具有抑制作用，但处于实验阶段，需要进一步临床研究。如何有效地运用细菌耐药机制研发新的抗菌药物、开发新型疫苗，控制耐药现状、阻断Spn及其相关疾病的传播等一系列科学问题，都需要进一步探究。