番茄红素防护肾脏缺血再灌注损伤及其对自噬机制的影响*

曾 敬，杨小利，刘渔凯，谢红英

（中国人民解放军陆军军医大学附属大坪医院心血管内科·重庆市心血管病研究所，重庆 400042）

肾脏缺血再灌注损伤（RIRI）是临床常见病理现象，肾移植、肾脏及其血管外科手术、体外冲击波碎石等均有可能引起RIRI[1]。肾脏缺血再灌注会引起细胞凋亡和坏死，由此引起急性肾小管坏死，从而损伤肾脏功能，还可能影响肾脏功能的恢复，使疾病死亡率升高[2]。番茄红素（lycopene）是植物中的一种天然色素，主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中，具有强大的抗氧化作用[3]和促进细胞自噬的作用[4]。既往研究证实，番茄红素具有防护细胞及组织缺血再灌注损伤的作用[5-6]，但主要集中在心、脑等器官，对番茄红素在肾脏缺血再灌注损伤中的作用及其具体机制的研究相对较少。自噬作为实现细胞本身的代谢需要和更新的重要途径，是维持细胞内环境稳定的重要机制，在调节缺血再灌注损伤中起到了重要作用[7]。其中LC3 Ⅱ是自噬的特异性蛋白，在自噬的调节机制中有关键性作用[8]。本研究中通过大鼠肾脏缺血再灌注模型，观察番茄红素对肾脏缺血再灌注后肾脏组织的影响，同时利用自噬抑制剂3-MA 来明确番茄红素是否通过激活自噬途径来减轻肾脏缺血再灌注损伤。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：选用健康雄性SD 大鼠（SPF 级）20 只，周龄8 ～9 周，体质量200 ～250 g，由陆军军医大学附属大坪医院动物中心提供（动物许可证编号为SCXK ＜渝＞2017-0006）。大鼠均给予常规喂养。符合陆军军医大学实验动物伦理委员会的伦理审查要求。

试药：番茄红素（Sigma Aldrich，批号75051）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、ATP 酶活性等均通过检测试剂盒检测，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；其余试剂及有机溶剂均为分析纯（Sigma Aldrich）。

1.2 模型建立及动物分组

所有大鼠给予腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，腹正中切口，切除右侧肾脏，游离左侧肾脏，备用。将大鼠随机分为4 组：1）假手术组（A 组），术前30 min腹腔一次性注射等体积的0.9%氯化钠注射液，全身麻醉后完成前文描述的手术部分后，与其他组动物放置相同的时间。2）缺血再灌注组（B 组），术前30 min 腹腔一次性注射等体积的0.9%氯化钠注射液，用血管夹夹闭左侧肾蒂缺血1 h，打开血管夹再灌注1 h。3）番茄红素+缺血再灌注组（C 组），术前30 min 腹腔一次性注射番茄红素（20 mg/kg），用血管夹夹闭左侧肾蒂缺血1 h，打开血管夹再灌注1 h。4）番茄红素+3 -MA +缺血再灌注组（D 组），术前30 min 腹腔一次性注射番茄红素（20 mg/kg）+3-MA（20 mg/kg），用血管夹夹闭左侧肾蒂缺血1 h，打开血管夹再灌注1 h。结束后，取上述4 组大鼠左侧肾脏，去除包膜，洗净肾内残余血液，拭干，称取0.5 g 制成组织匀浆，用不同试剂盒测定各组MDA含量、SOD 活性、Na+，K+ -ATP 酶和Ca2+/ATP 酶活性，并通过比较B 组与A 组大鼠的病理、生化改变，确定模型建立是否成功。

1.3 检测指标

肾脏病理：实验肾脏组织经10%福尔马林固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片，按HE 染色流程染色，显微镜下观察病理结构变化。

肾脏LC3 ⅡWestern Blot：取实验肾脏组织，液氮研磨后加含有1 μmol/L 的RIPA 裂解液（碧云天，P0013B）裂解提取蛋白，SDS-PAGE 电泳跑胶后半干转至NC 膜，1 ∶1 000 比例稀释LC3 抗体（Sigma Aldrich，L8918）和GAPDH（Sigma Aldrich，G9545）并孵育过夜，HRP 二抗孵育并常规显色，使用Odyssey 扫膜仪扫描条带后统计LC3 Ⅱ与GAPDH 的比值并计算。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计学软件分析。计量资料以表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对各指标的影响

结果见表1。可见，与A 组相比，B 组大鼠MDA 含量明显增高，SOD 活性明显下降。与B 组相比，C 组大鼠MDA 含量明显降低，SOD 活性明显升高；D 组大鼠番茄红素对肾脏缺血再灌注后MDA 和SOD 的作用明显减弱。与A 组比较，B 组大鼠的Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性显著下降（P ＜0.01），提示肾脏组织在缺血再灌注过程中发生脂质过氧化，Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性受到抑制；经番茄红素处理后，Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性显著增强（P ＜0.05），表明番茄红素能减轻肾组织的脂质过氧化损伤，保护肾脏功能。D 组的ATP 酶活性下降，表明上述保护作用可被3-MA 抑制。

表1 番茄红素对肾脏缺血再灌注大鼠肾脏组织中各指标的影响（± s，n=5）

表1 番茄红素对肾脏缺血再灌注大鼠肾脏组织中各指标的影响（± s，n=5）

注：与A 组相比，*P ＜0.05；与B 组相比，#P ＜0.05；与C 组相比，&P ＜0.05。图2 同。

组别A 组B 组C 组D 组MDA（nmol/g）27±5 48±12*37±9#44±7&SOD（U/g）118±21 77±16*115±31#88±13&Na+，K+ -ATP 酶（μmolPi/mg·Pr·h）4.5±1.2 2.3±0.6*3.5±1.3#2.7±0.5&Ca2 + /ATP 酶（μmolPi/ mg·Pr·h）5.8±1.5 3.1±1.7*4.6±1.4#3.5±1.1&

2.2 减轻肾脏缺血再灌注损伤

肾脏缺血再灌注后HE 染色切片显示，缺血再灌注引起肾小管上皮细胞肿胀，而番茄红素能明显减轻缺血再灌注引起的肾小管上皮细胞肿胀；但在D 组中，番茄红素保护作用明显减弱，提示番茄红素的保护机制有可能是通过调控细胞的自噬活动。见图1。

图1 肾脏缺血再灌注后各组肾脏组织切片HE 染色（×400）

2.3 增加肾脏自噬相关蛋白LC3 Ⅱ表达

LC3 Ⅱ的形成是自噬增强的一个指标，通过对各组大鼠肾脏LC3 Ⅱ表达量的检测，发现缺血再灌注引起肾脏LC3 Ⅱ表达升高，番茄红素可进一步增加肾脏缺血再灌注时LC3 Ⅱ的表达，但3-MA 可阻断番茄红素对LC3 Ⅱ表达的上调作用，提示番茄红素可能通过激活肾脏自噬而改善缺血再灌注损伤。见图2。

图2 肾脏缺血再灌注后各组肾脏组织LC3 Ⅱ蛋白水平

3 讨论

持续性的肾脏缺血将造成不可逆的损伤，尽快恢复肾脏的血供是治疗肾脏缺血的前提，但再灌注的同时也可能带来进一步的肾脏再灌注损伤[9]。氧化应激和自噬都是组织细胞在缺血再灌注过程中都存在的病理生理现象。缺血再灌注导致的组织细胞损伤主要与自由基、钙超载、白细胞增加、高能磷酸化物缺乏等密切相关[10]。而自噬一般被认为是细胞在氧化应激及营养匮乏等条件下的一种自我保护机制。通常情况下，自噬维持在较低水平，但ATP 能量耗竭、活性氧的释放、线粒体膜通道的开放都会导致自噬活性迅速升高，故在缺血再灌注过程中的自噬活性增强。

在肾脏缺血再灌注损伤过程中，由于组织缺血缺氧，ATP 生成减少，膜泵失效，细胞内Ca2+增加，激活Ca2+依赖性蛋白酶，使黄嘌呤脱氢酶大量转变为黄嘌呤氧化酶，而黄嘌呤氧化酶催化产生大量的活性氧自由基可损伤组织[11]。MDA 是膜脂过氧化的重要产物，能加剧细胞膜的损伤，因此通过MDA 了解膜脂过氧化的程度，可间接测定膜系统的受损程度，升高提示组织或细胞损伤明显[12]。SOD 是组织自身存在的一种抗氧化金属酶，能催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中可起到至关重要的作用[13]。肾小管基底膜内侧膜有Na+，K+-ATP 酶，主要起到排Na+保K+的作用，是维持细胞内Na+和K+浓度稳定的重要调节酶，在缺血再灌注损伤时，其调节功能受到损伤[14]。同样，在缺血再灌注损伤发生时，还可造成Ca2+-ATP 酶受损，这也是引起细胞内Ca2+超载的原因之一[15]。既往研究表明，番茄红素对心、脑缺血再灌注损伤具有保护作用[16]，其保护机制除了抗氧化作用外，还有激活细胞内自噬活动的作用[4]，而对肾脏缺血再灌注过程中自噬的影响尚不明确。

本研究结果显示，肾脏缺血再灌注后肾脏组织的MDA 含量明显增高，SOD 活性明显下降，其酶活性也明显下降，证实了缺血再灌注对肾脏造成了损伤，确定了建模的成功。在给予番茄红素处理后，其MDA 含量明显降低，SOD 活性明显升高，酶活性同样得到一定程度的恢复，说明了番茄红素对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。同时，HE 染色结果也支持上述结论。在对番茄红素与自噬相关性的研究中发现，通过检测LC3 Ⅱ表达量的变化，应用番茄红素处理后大鼠肾脏LC3 Ⅱ表达明显升高，使用自噬抑制剂3-MA 可明显减弱番茄红素对LC3 Ⅱ表达升高的作用。同时，使用3-MA 后，由生化学和酶学的研究结果可见，番茄红素对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用被抑制，提示番茄红素可能是通过自噬减轻了肾脏的缺血再灌注损伤程度。

综上所述，番茄红素在肾脏缺血再灌注损伤中具有保护作用，其机制可能是通过激活自噬来减轻肾脏缺血再灌注损伤。