猫冠状病毒分子进化、免疫病理机制和疫苗研究进展

刘玉秀 ， 黄柏成 ， 田克恭

(国家兽用药品工程技术研究中心 ， 河南 洛阳 471000)

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)具有2种血清型(I型和II型)，又分为2种生物型或病理型，一种是猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus，FECV)，主要引起轻度到重度肠炎；另一种是猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)，主要引起感染猫腹膜炎、眼膜炎及神经症状等。FIPV被认为是FECV缺失突变体，其在猫群中不存在水平传播，具有抗体依赖性增强特性，接种疫苗后高水平的抗体反应会加快传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)的发展。本文对猫冠状病毒的分子生物学、FECV/FIPV突变的组织嗜性改变机制、FIPV感染的病理学成因及免疫效力评估进行了总结，以期为国内猫冠状病毒的防控提供科学依据。

1 猫冠状病毒基因组

猫冠状病毒(FCoV)是冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Coronavirinae)α冠状病毒属(Alphacoronavirus)成员，是家猫和野生猫科动物主要传染性病原之一。根据不同的临床表现形式，FCoV通常被认为具有2种生物型或病理型，一种是在大多数健康猫群中普遍存在的猫肠道冠状病毒，可引起轻度到重度肠炎；另一种是猫传染性腹膜炎病毒，以导致感染猫全身系统性、强致病力的传染性腹膜炎为特征，亦可引起感染猫肠炎、轻度至严重眼疾及神经系统疾病[1]。

FCoV基因组约29 kb，11个开放性阅读框(ORFs)，编码4种结构蛋白：棘突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白，7种非结构蛋白3a、3b、3c、7a、7b及复制酶1a和1b[2]。病毒螺旋核衣壳由N蛋白包裹多个RNA拷贝而组成，N蛋白主要保护病毒基因组，可诱导机体产生细胞免疫[1]。M蛋白是病毒含量最丰富的糖蛋白,其通过3个跨膜结构域随机分布在病毒包膜上。E蛋白是插入病毒包膜中的III型膜蛋白，含量远小于M蛋白和S蛋白，其缺失不影响病毒复制，但会减弱病毒毒力[3]。S蛋白属于I型病毒融合蛋白，是病毒进入宿主细胞的主要调节因子。FCoV的16个非结构蛋白由1ab，3abc和7ab基因编码，1ab编码的复制酶复合物参与转录，生成用于转录结构蛋白和辅助蛋白的模板[4]。3abc辅助蛋白中的3c与FCoV毒力和组织嗜性变化有关[1]。7ab参与FCoV感染的免疫反应，7a蛋白是一种I型干扰素拮抗剂，7b蛋白可诱导自然感染猫的抗体反应[5]。

2 猫冠状病毒血清型

FCoV根据S蛋白氨基酸序列和抗体交叉中和差异分为2种血清型：I型和II型[6]。血清I型是主要流行毒株类型，其S蛋白完全来源于FCoV[1]。血清II型FCoV临床不常见，由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)和FCoV双重重组而来。生物信息学分析和抗体中和试验表明，血清II型FCoV和CCoV的S蛋白序列间相似度高[6]，79-1146株S基因与CCoV及猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S基因相似率(分别为91%和81%)显著高于血清I型FCoV(46%)[7-8]。多数体外分离和培养的FCoV毒株为血清II型，而临床流行更广的血清I型FCoV难以分离，严重阻碍了对FCoV的体外研究。

3 猫冠状病毒生物型

血清I型和II型FCoV毒株均存在2种在抗原和形态学上不同的生物型(或病理型)：FECV和FIPV。FECV在野猫中感染率可达90%[9]，一般无症状或轻微肠炎症状，而FIPV则致病性极高，引起感染猫致死性传染性腹膜炎。研究认为，FIPV是感染猫体内FECV突变产生的一种变异生物型[10-11]。2种生物型的组织嗜性和生物特性存在较大差异，FECV经粪口途径在猫群中传播，而FIPV与感染动物细胞和组织紧密结合，极少情况下才有可能在粪便或尿液中排毒，不具有水平传播能力。这种机制类似于猫白血病病毒(Feline leukemia virus，FeLV)感染猫后突变为猫肉瘤病毒(Feline sarcoma virus,FeSV)，FeSV在自然界中不能水平传播，但FeLV可在猫的各种排泄物和分泌物中排出并可水平传播[12]。

病毒嗜性的变化是病毒与宿主细胞相互作用的结果，宿主细胞中受体、共受体、生化条件(如蛋白酶、离子、pH)的存在或缺失都可能是这些变化的决定因素。突变理论表明，无症状的FECV感染猫暴露于反复的“感染-康复-再感染”循环中，体内FECV突变将致使病毒毒力和组织嗜性扩大而成为FIPV，但失去病毒传播特性[1,13]。S、3abc和7ab基因被证实存在这种突变[14-17]。S基因的突变可能是FECV突变为FIPV的关键，特别是编码S1/S2裂解位点区域。FECV具有一个可能被类糠蛋白酶裂解的S1/S2序列，而FIPV具有一个可被其他蛋白酶激活的S1/S2突变序列，这表明FCoV生物型转变需要S蛋白酶激活[14]。位于S蛋白融合肽区域的突变也被认为与FECV/FIPV特异性突变有关。Chang等发现S2蛋白存在的M1058L突变几乎可完全区分(>95%)来自健康猫和病猫中的FECV和FIPV序列[15]。Porter等后期也发现，M1058L突变与肠道或全身性FCoV感染一致性[16]，77%的FIP猫和100%的非FIP猫粪便样品中FCoV S2蛋白1 058位点为Met，而91%的FIP猫和89%的非FIP猫组织样本中此位点为Leu，但仅由S蛋白的突变不能完全将FIP从FCoV阳性样本中区分出来。3abc和7ab的ORFs突变也与FCoV生物型转换有关，多项研究认为3c基因的截短是FECV突变成FIPV的决定因素[1,17]，3c基因的截短或缺失常与FIPV生物型相关，而完整或非截短的3c基因与FECV相关[17]。在病猫组织中检测到的FCoV总存在1个或突变或截短或缺失的3c基因，疑为FIPV，而健康猫体内的FCoV具有完整的3c基因[1]。3c基因功能的丧失并不能阻止病毒体内或体外复制，但可通过增强巨噬细胞内FIPV的内化和复制来显著改变细胞趋向性。相反，亲本FECV更倾向于感染肠道成熟的顶端上皮细胞。

4 发病机制

FCoV感染潜伏期可从几周至几年不等，感染初期具有轻微的上呼吸道或肠道症状，但许多猫在感染FCoV后无任何临床症状[1]；FECV感染1周内就可通过粪便排出，可持续4～6个月，或在6～8个月内被清除，或可持续排毒18个月[18]。高抗体滴度(1∶100)的猫比低抗体滴度(1∶25)的猫可能更易排FECV[18]。

FIPV感染细胞至少需要2种细胞受体，第1种是细胞膜上的氨基肽酶N(Aminopeptidase N，APN)，其具有S蛋白表位特异性，猫APN是血清I型FIPV受体，但不一定是血清II型FIPV的受体[19]。有趣的是，猪和人APN不能作为FIPV受体，但两者的嵌合体能作为FIPV的受体[20]。第2种是巨噬细胞上的Fc受体。FECV一旦突变为FIPV，就获得识别巨噬细胞Fc受体和在巨噬细胞中大量复制的能力。巨噬细胞上的Fc受体能够结合病毒抗体复合物，促使FIPV感染的巨噬细胞进入淋巴结区域进行病毒大量复制，由此产生的病毒血症可使携带病毒的巨噬细胞沉积在血管内皮细胞中[21]，之后巨噬细胞附着并通过静脉壁迁移，引起血管周围的局部反应造成脓性肉芽肿，从而形成组织内FIP基本病变。

猫免疫系统有几种机制来控制早期FIPV感染。抗体在体外可以中和FIPV，但在体内似乎有助于FIP的发生，可能由2种原因造成：首先，抗体结合病毒可能阻断APN受体，阻止病毒与细胞的粘附，但通过补体结合(Fc)受体增强了巨噬细胞对病毒的吸附，这种抗体依赖增强(Antibody-dependent enhancement，ADE)效应对猫抗体和巨噬细胞具有特异性，并且可能涉及病毒S和M蛋白的抗体[21]；其次，病毒抗原可能不会排列在受感染巨噬细胞表面，从而限制中和抗体与病毒结合。感染抗体阶段以一种迅速蔓延的以浆膜/网膜为中心的炎症为标志，这种反应集中在小静脉周围，可造成脓性肉芽肿病变，周围有大量富含蛋白质的水肿液和少量淋巴细胞、中性粒细胞和浆细胞,这个反应称为阿尔萨斯型超灵敏反应[22]。

FIP具有渗出性(湿性)和非渗出性(干性)2种临床形式，主要由细胞介导及受感染巨噬细胞对病毒反应方式的改变造成。如果细胞免疫在感染早期产生并足够强可抑制病毒复制，就不会出现FIP临床症状；如果感染过程仅发生体液免疫且细胞免疫激活失败，则会导致渗出性FIP。也可能出现体液免疫和细胞免疫都很强，病毒被控制的程度远大于渗出性疾病发展，但又未完全消除则会引起病毒复制和消除之间的拉锯战，导致非渗出性FIP，后者以更典型的肉芽肿为特征。无论哪种感染表现的FIP都会导致致命性免疫介导的血管炎，从发病到死亡的时间因两种形式而异。渗出型病例常在发病2个月内死亡，具体临床症状取决于受血管炎影响的脏器系统；非渗出型病例猫常有眼部症状，25%病例出现进行性神经症状，眼部和神经症状由这些组织中肉芽形成引起的慢性病程[18]。

5 猫冠状病毒感染疫苗接种的风险与效益评价

幼猫在6周龄前因母源抗体保护，免受FCoV感染，此后90%猫暴露于FCoV后会发生血清抗体转阳，一旦出现FIP，暂无有效治疗药物，死亡率100%。FIP潜伏期几周至几年不等，这种巨大差异给防疫工作带来严峻挑战。1991年辉瑞制药有限公司开发的Primucell FIP减毒活疫苗，可局部刺激IgA和中和抗体产生[23]。

研究发现，FIP减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗免疫猫后均可观察到ADE[23-24]，使FIP潜伏期缩短至1～2 d，病程更短，死亡更快。FIP疫苗在瑞士2个 高危猫群临床应用显示[25]，猫在疫苗接种后1个 月内出现FIP，接种安慰剂猫则没有出现FIP。虽然不能确定单个病例的FIP是否由ADE引起，但FIP疫苗的免疫带来的益处却远低于预期。在FIP流行地区，与接种安慰剂对照组相比，FIP疫苗免疫的猫发病率没有任何下降。在12个不同区域进行为期6个月的疫苗田间试验中，349只猫2次免疫Primucell FIP疫苗后有3例FIP发生(0.86%)，352只 猫免疫安慰剂疫苗有4例发生(1.1%)[26]。瑞士双盲安慰剂田间试验，138只16周龄纯种猫在接种后15～21个月内，疫苗接种组有7例FIP死亡，安慰剂组有5例死亡[27]。在地方性流行地区，幼猫多在6～7周 龄感染，远早于疫苗推荐的首免时间(16周龄)， 高危宠物猫群中疫苗保护效力有限甚至没有效力，如田间试验显示，免疫后12个月，免疫组13/31 死亡，对照组17/34死亡[25]。另一项研究显示，在免疫后150 d内免疫组死于FIP为12只，安慰剂组为10只，免疫后250 d内，2组死于FIP数量相当，均为13只[27]。在临床应用中，Primucell FIP疫苗在免后8～12个月，均未能有效降低高危猫群FIP发病率。

Primucell FIP疫苗免疫保护效果取决于免疫猫暴露于FIPV的剂量[23,28]，当免疫猫暴露于低剂量强毒(<10 猫感染剂量)可见部分保护，当暴露于超过10个感染剂量(104TCID50)时，疫苗则不能保护。当感染较高剂量强毒时，多数免疫猫比未免疫猫更容易感染，表现更急性更严重疾病。

6 展望

FCoV的感染致病机制因病原特殊性而变得越发独特复杂。APN特定区域的细微差异可以从根本上改变物种，甚至血清型趋向性。FECV巨噬细胞趋化性的获得似乎是其向FIPV转化的一个重要步骤，即从一种非致病性和局限性的肠细胞病原体向一种高毒性和全身性的单核细胞/巨噬细胞病原体转化。

FECV及其转化的FIPV基因型毒株中存在由不同程度的单核苷酸多态性和插入/缺失现象。同一地区猫群中分离株间基因差异很少能超过12%，但是不同地区猫群中冠状病毒差异可达20%以上，这给疫情防控带来极大挑战。

FIP疫苗免疫的益处比想象的少。第一，免疫组和对照组免疫保护率没有明显区别；第二，免疫后由于ADE导致免疫组免后1个月死亡数高于未免疫组；第三，许多幼猫一般在6～7周感染FCoV，远早于疫苗推荐首免时间。针对FIP的疫苗研发还需要更多的探索，如对最佳接种日龄的优化和克服ADE特性等。