白酒酿造过程中的微生物研究进展

梁栩煜 ，钱 敏，白卫东*，肖更生，刘功良，俞剑燊，郭 波

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225；2.上海金枫酒业股份有限公司，上海 200120；3.广东石湾酒厂集团有限公司，广东佛山 528031）

白酒是中国传统发酵食品中的一颗明珠。中国传统白酒在中国的发展历史上源远流长，是采用饱含丰富淀粉质（糖质）的粮谷类为主要酿造原料，以曲类或者酒母等为糖化发酵剂，采取固态、半固态或液态酿造等形式，经过蒸煮、发酵、蒸馏、贮存和勾调而成的蒸馏酒，已是驰名中外的蒸馏酒之一[1]。

白酒发酵的全过程均是依赖微生物的繁殖及代谢而得以进行。参与酿酒发酵的微生物不可胜举，因在酿酒的每一个过程都有各式各样的微生物产生并发挥作用，如在制曲车间所形成的微生物环境可带给曲饼富饶的微生物、制作酒曲的过程中由曲饼自身发酵所产生的微生物、酒曲与原料混合并与生产车间所在现场的环境微生物结合共同产生的微生物等。不但有自然环境中的微生物参与其中，还有通过技术人员培育的纯种且高产的微生物；既有产香菌、产酒菌、糖化菌等对生产白酒有益处的微生物，也有造成白酒产生不愉快气味的的无益菌群[2]。

白酒酿造过程中微生物的种类、数量、分布及其消长变化等能直接影响酒的风味质量，是影响典型香型形成的重要因素[3]。因为白酒酿造的本质是其微生物繁殖代谢的结果，研究意义显而易见，也是科研人员一直以来重点研究白酒微生物的原因。因此，对近年来白酒酿造过程中的微生物和利用现代分子学技术检测出的白酒微生物进行综述，以从微生物的角度深入了解白酒的发酵本质。

1 白酒酿造中的微生物

1.1 细菌

细菌（bacteria）是一类细胞细短、结构简单、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物，多在温度适宜、湿度较大和饱含有机质的环境生存[4]。白酒生产过程中细菌的种类各色各样，相对较为集中的细菌有乳酸菌、醋酸菌、芽孢杆菌等。

1.1.1 细菌在白酒酿造中的多样性及其变化

从细菌在白酒酿造期间的菌落结构变化上来看，细菌群落结构在每一个阶段都表现出一定的规律。如翟磊等[5]对宜宾产区浓香型白酒酿造环境中细菌的菌落结构进行分析，实验结果表明，窖泥中的微生物多样性最高，大曲次之，酒醅和黄水中微生物多样性最低；其中乳酸菌在窖泥、大曲、酒醅以及黄水中都是主要菌群；且在白酒酿造过程中微生物群落结构呈现出从多种微生物共同作用转化为功能微生物主要发挥作用的趋势。任爱容等[6]对酱香型白酒连续七轮次的大曲和酿造环境的样品进行研究，实验结果表明，各轮次大曲与环境样品中细菌的复杂性均存在差异，但其主要功能细菌菌群组成及其变化过程基本保持一致，且其中的优势细菌都能代谢丰富的酶系。胡小霞等[7]通过对酱香型白酒一轮次堆积和窖池发酵酒醅中的细菌菌群进行研究，实验结果表明，前期堆积细菌的多样性和丰富度都比窖池酒醅高；在窖池发酵期间，细菌的多样性和丰富度呈现快速降低；到了窖池发酵后期，微生态即从繁杂的多菌属生态结构发展到以单一的乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主导的生态结构。胡小霞等[8]对清酱香型白酒陶坛发酵过程中酒醅的细菌群落进行研究。实验结果表明，清酱香型白酒的关键细菌群落结构同时拥有清香型和酱香型白酒关键细菌群落结构的特点。在发酵旺盛时，因存在协同与竞争关系，虽约1/5的主要细菌属浓度显著降低，但约3/4显著升高；在发酵后期，主要细菌属的群落组成基本不变，其相对丰度都＜25.97%。且平均81.12%的主要细菌属之间呈显著正相关，18.88%的呈负相关。

1.1.2 细菌对白酒风味物质的作用

细菌在酒曲培制和白酒酿造中扮演着重要的角色，其代谢产物对白酒的香型和风味具有特殊作用，所以在酿酒过程中适当引入细菌不仅可积累一些香味物质或香味前体物质以达到增香效果[9]，还能克服白酒后味不足的缺点。如徐岩[10]就细菌与香味前体物质之间的关系作了深入研究，发现茅台酒吡嗪类化合物中浓度最高的是四甲基吡嗪，高达1.6～2.0 mg/L，并通过白酒生产工厂的实践确认其可提高茅台酒在空杯中的酒香味更为持久的特点。因枯草芽孢杆菌可高产四甲基吡嗪，且酱香大曲中重要的产酶细菌包括蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等[11]，其中枯草芽孢杆菌的蛋白酶活力极强，故推断其特性对产出四甲基吡嗪的作用巨大。

从白酒风味物质产生的影响上来看，细菌的作用对白酒生产举足轻重，比如能够显著提高发酵液的蛋白酶活力、氨态氮浓度和酯化能力的功能性细菌群[12]。以酱香型已制成的酒曲为例，大曲里绝大部分的微生物都为细菌，数量高达107个/g曲[11]，因此此曲又被称为“细菌曲”[13]。如泸州老窖在制作大曲期间有着不胜枚举的细菌参与其中，多数为芽孢杆菌属、醋杆菌属等[14]。经研究证明[15]，芽孢杆菌是酱香型白酒中形成成百上千种风味物质的关键功能细菌，其能够代谢复杂多样的酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，其能分解薯类、大米、高粱等用于酿酒的原辅料，分解后形成各种各样的氨基酸、糖类等物质，进而经过继续发酵所产生的一连串生物化学变化而形成具有独特风味的的芳香类化合物。另据研究发现[16-17]，酱香高温大曲制曲过程中各式各样的游离氨基酸能够形成美拉德反应，极力推动了酱香这种别具一格的风味产生，关键是芽孢杆菌促使了这一反应的进行。

1.2 酵母菌

酵母菌是一种单细胞真菌，被归类为兼性厌氧微生物，能发酵糖类产生酒精，多数在糖浓度高且较为酸性的条件下生存[4]。在制曲时，生产工具是被酵母菌加进到酒曲里所利用的其中一种介质，酵母菌再经过连续繁殖，形成整个发酵过程内关键的功能微生物之一[18]。

1.2.1 酵母菌在白酒酿造中的机理

酵母菌本身含有丰富蛋白质，尤其是含有13种酶系统，生物活性物质如氧化还原酶的辅酶烟酰胺类、脱羧酶的辅酶（coenzyme A，CoA）、还原型的谷胱甘肽和核糖核酸酶等[19]；另外，酵母菌在缺氧环境时根据糖酵解途径，将糖经过一连串的酶催化后生成丙酮酸，在同一环境下，丙酮酸经乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶转化成乙醇。白酒酿造期间，酿酒主辅料被酵母菌分泌的胞外酶分解，经过一连串的酶催化和产物间的复杂变化，从而形成香、纯、厚等各种风味的酒体。

1.2.2 酵母菌在白酒酿造中的作用

酵母菌在白酒发酵过程中担任酒化与酯化的角色[20]，酿酒酵母主要起产酒精作用，具有强的产酒精能力[21]。研究表明，在白酒发酵期间存在各式各样的酵母相互影响，其中酿酒酵母是优势酵母[22]。其他大部分属于产酯酵母，虽然其产酒精量比较少，但白酒在发酵期间能够将醪液中的粮谷类转化为醛、酯、高级醇等[23]，即酯化酸类、醇类等物质，并形成以乙酸乙酯为主要酯类的风味物质，这种作用在酱香型白酒酿造中使得酱香白酒的质量得以提高[24]。

1.2.3 酵母菌在白酒酿造中的应用

在白酒酿造期间，通过调控各阶段酿酒酵母数量的变化，则能控制酒精的产出进而提高白酒的质量，因此可体现出酵母菌在厌氧发酵这一过程举足轻重。如产酯、产膜酵母在白酒发酵时因其喜于有氧特性，代谢过程产生丰富酯质，是酿制白酒产酯香的重要菌种[25]。酿酒酵母和非酿酒酵母常同时用于白酒的酿造，如将异常毕赤酵母和酿酒酵母按比例混合加入其中，不但能够确保白酒的出酒率，更能明显提高白酒风味物质的含量，其中乙酸乙酯含量的提高尤为突出[26]。

研究技术人员已经从酒曲饼和发酵液中分离并纯化出各式各样种属的酵母，包括有酿酒酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属等[27]。WU Q等[28]就酵母菌在茅台酒酿造过程中生长繁殖及其代谢的研究发现，种类丰富的酵母存在于茅台酒发酵液中，且在整个发酵期间酿酒酵母一直活跃于其中，属于优势酵母。马荣山等[29]从酱香型白酒发酵液中筛选出7株酵母菌，通过制曲筛选出5株具有高酶活性和高发酵性的酵母菌，将其作为酒曲发酵菌种，用此酒曲来酿造的酒其酱香味独特，口感柔润细腻，回味持久，酱香格调别具一格。将酱香型醪糟中的优势酵母都投入到实际生产中，产出酒的醇甜味比标准酒样显著[30]。

1.3 霉菌

霉菌常见于周围自然环境，其菌丝体由两部分菌丝组成且较为旺盛，孢子具有较强抗逆性的真菌类型，菌落较蓬散干燥且菌丝体发达，因此其生长繁殖能力较高[4]。

1.3.1 霉菌在白酒酿造中的机理

在白酒酿造过程中分离出的主要真菌除酵母菌外，便是霉菌；其糖化力可以把某些含有淀粉的原料分解成还原糖并被微生物利用。此外，霉菌的液化力和酯化力也大力促进发酵液中淀粉、蛋白质等物质的分解与转化，使得整个发酵过程中的糖类及氨基酸浓度上涨，不仅能为发酵体系内的微生物代谢供应营养，更为白酒可产生独特的风味提供保障[31-32]。

1.3.2 霉菌在白酒酿造中的作用及其变化

霉菌会通过不断地生长繁殖代谢等途径产生对白酒香气成分有影响的物质，如根霉菌产生的代谢产物具有甜味。目前霉菌多被利用在小曲酒的酿造，如吴雪梅[33]对豉香型白酒酒曲微生物进行研究，检测到一级种均以毛霉为主，米根霉其次。饼丸则均以米根霉为主，华根霉或毛霉其次。酒饼多以米根霉为主，华根霉较多，有时甚至占优势，毛霉占1/5～1/3，各霉菌比例较均衡。在白酒发酵期间，黑曲霉通过消耗有机酸来调节酒醅中微生物的数量及其多样性。同时，它分泌大量的生物酶及其代谢产物都有很高的酯化力，使得白酒风味饱满从而提升酒的质量[34]。另外，黑曲霉在酒曲表面发酵期间能分泌许多糖化和液化酶，其强糖化力可以将淀粉水解生成葡萄糖并供酵母菌直接利用[35]。霉菌的类别、数目和生长情况等对白酒酿造过程及其成品的影响尤为重要，特别是对发酵有着径直效力的功能菌群，对白酒香型、产量和品质都产生直接的影响[36]。

1.3.3 霉菌在白酒酿造中的应用

酒曲含有丰富多样的霉菌，如曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）、红曲霉（Monascus）等。不计其数的霉菌附着在酒曲上并快速生长形成孢子，因其抗逆性较强且能在温湿度较高的条件下生长代谢，并产生能分解酿酒原料中蛋白质等物质的各样水解酶类，从根本上提高白酒的质量。如黄丹等[37]从泸州老窖酒曲中筛选并纯化获得高产酯化酶的根霉菌，其细胞内酶活性达7.91 U/mL。根霉菌在酒曲培养期间可以转化出一连串酯类、醛类等风味成分，个别根霉可以产生乳酸，因此根霉菌在白酒酿造期间大大影响着其乳酸含量和酸度平衡[38]，则说明霉菌在酒曲中的种类、数量对酒曲质量和白酒的风味品质，起着决定性的影响[39]。

因白酒酿造过程中微生物菌落呈现复杂多样性，而酿酒经过体系内各种微生物的相互作用，对白酒的品质和产量都有至关重要的影响。随着对白酒生产中微生物的深入研究，其主要微生物正渐渐被揭示。

2 利用现代分子生物学技术揭示白酒酿造微生物

在科学技术不断发展的今天，现代分子生物学技术的发展飞快，因其能够快速精确检测等特性遂逐渐取代传统的微生物分离培养技术，现代分子生物学技术的应用为白酒酿造微生物菌群的深入探究提供了重要的研究方向。

2.1 白酒酿造中优势菌群的分析

翟平平等[40]通过聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术研究白酒小曲细菌的复杂性，研究结果发现，小曲细菌类别远低于大曲，其大部分细菌类别为黄单胞菌属、片球菌属以及乳杆菌属等，其中以戊糖片球菌为主的乳酸菌属于优势种群。董士伟[41]通过PCR扩增16S rDNA技术对从豉香型白酒酒曲中筛选出的高产四甲基吡嗪菌株进行了测序并构建系统发育树，确认此菌株为枯草芽孢杆菌，且为优势细菌。LI X R等[22]基于核糖体高通量测序分析汾酒酿造期间的优势菌群，结果表明汾酒在酿造过程中大部分细菌是乳杆菌科，真菌中大部分是酵母科和复膜孢酵母科。谢国排等[42]利用嗜热细菌产芽孢与蛋白酶的特性，通过高温作育、热处理等技术手段，从金种子浓香型大曲中分离出6株产蛋白酶的嗜热细菌，利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析其单菌种液体发酵中的香气组成，发现6株菌株都检测到酯类、芳香族化合物、酚类等风味物质且其含量各异。刘效毅等[43]利用传统的分离方法和分子生物学相结合，分析酱香型高温大曲中微生物的复杂性，鉴定出的147株微生物中，细菌约占2/3，霉菌约占1/3，细菌和霉菌均分离出12个种类，芽孢杆菌属为细菌的优势菌群；体现出酒曲中菌群的复杂性。LI Z M等[44]研究表明，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌是酿酒大曲中具备较高α-淀粉酶、葡糖糖化酶活性的优势菌群。

2.2 白酒酿造中微生物菌群多样性的分析

利用现代分子生物学技术对白酒酿造过程中的微生物进行分析，大部分从对其鉴定、微生物检测及其群落结构分析方面着手，其中对菌群的分析较多。黄治国等[45]通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术检测区域差异对酱香型酒醅细菌群落的影响，实验结果显示，不同细菌群间存在协同或此消彼长的关系，因酿造环境、温湿度、操作流程等差异，使得酒醅细菌群落多样性较大和相似性偏低。潘勤春等[46]通过PCR-DGGE手段分析汾酒酒曲的细菌群落组成，实验结果发现了5个不可培养的细菌类别，拓宽了酒曲微生物物种数据库，并表明汾酒大曲中的细菌大部分为芽孢杆菌。高亦豹等[47]同样通过PCR-DGGE图谱手段分析高温和中温大曲细菌群落组成，结果发现不同酿酒工艺的大曲细菌群落组成具有显著差异，并检测出传统方法暂时不可培养鉴定的细菌种属。张会敏等[48]通过16S rDNA克隆文库的技术，检测古井贡酒高温大曲细菌群落结构及其多样性，并通过分子鉴定确定大曲中主要细菌菌落组成比例，并研究了其相应的进化链。陈玲等[49]通过结合16S rDNA克隆文库法和高通量测序法，对大曲中细菌群落的组成及丰度进行了分析，结果表明通过两种方法分析得出大曲中主要微生物的种类和数量比例相近，特别是其优势微生物群落基本一致。

3 结论与展望

尽管现在在白酒微生物方面的研究大多是针对某些功能菌株的探究，但对微生物的类型、生长繁殖状况、彼此作用原理等研究有待深入，对微生物在白酒发酵中的共生或竞争等关系的探究更为重要；另外，白酒因有各自的特征风味从而形成不同的风格和香型，而微生物发酵则是形成白酒风味非常关键的环节，但目前对微生物如何产生风味物质等的研究却凤毛麟角，因此，未来白酒微生物的研究必须克难攻坚，着重研究并解析二者的关系，此举对白酒的研究领域必然贡献巨大。总之，若要真正的弄清楚白酒发酵的本质，还需结合利用现代分子生物学技术深入研究白酒发酵过程中微生物的各种变化，揭示白酒发酵过程中微生物多样性的变化规律及其代谢产物与风味物质的关系，这将对白酒生产实践意义非凡。