CysLT2受体拮抗剂HAMI3379抑制LPS诱导小鼠小胶质瘤细胞系的炎性反应

顾胜龙，李明星，应苗法，方三华，饶跃峰，赵 蕊*

(1.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 药剂科，浙江 杭州 310016； 2.浙江大学医学院 公共技术平台，浙江 杭州 310058； 3.浙江大学医学院附属第一医院 药剂科，浙江 杭州 310003)

脑缺血损伤是一个复杂的病理生理过程，在脑血管病中，缺血性脑损伤约占80%，其发病率高、致残率高和病死率高的特点，与心脏病、肿瘤构成人类的三大致死病因，严重影响着人类的健康和生活质量[1]。常见的发病机制包括能量代谢障碍、细胞内钙超载、兴奋氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎性反应及神经细胞凋亡等[2-3]。小胶质细胞的活化在脑缺血损伤后细胞免疫及炎性反应过程中扮演着重要的作用，活化的小胶质细胞释放大量的炎性因子、NO及过氧化物，导致神经元的凋亡，凋亡的神经元细胞能够激活小胶质细胞，引起炎性反应的恶性循环发生[4]。

5-脂氧酶产物半胱氨酰白三烯(Cysteinyl leukotriene, CysLT)是一类重要的炎性介质，在外周和中枢均具有调节免疫、炎性反应及组织的修复作用。研究发现，在大鼠局灶性脑缺血损伤后，CysLT1和CysLT2表达增加，CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特(montelukast)、普鲁司特(pranlukast)能够抑制CysLT1的表达，减轻炎性反应及神经元损伤，改善脑缺血损伤[5-6]。另有研究发现，采用100 ng/mL LPS处理BV-2细胞24 h，CysLT2的表达显著上调，诱导炎性反应的发生及神经元的损伤[7]。目前，已出现的CysLT2受体拮抗剂较少，选择性拮抗剂HAMI3379对炎性反应的调控及作用机制仍不明确。本研究主要探究CysLT2受体抑制剂HAMI3379对LPS诱导小胶质细胞炎性反应的调控作用及其可能的作用机制，以期为将来脑缺血损伤治疗药物的开发提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂：CysLT2受体抑制剂HAMI3379(Cayman公司)；LPS (Sigma Aldrich公司)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)； CCK-8试剂盒(Dojindo公司)；小鼠IL-1β、TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒(酶免试剂盒商城)；BCA试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；Iba1抗体(Novus生物制品公司)； PKCα、IKBα、NF-κB p50和p65、β-actin 抗体(Proteintech公司)。

1.1.2 细胞：小鼠小胶质瘤细胞系BV-2 (上海泽叶生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与分组：于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于含有5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养BV-2细胞；待细胞贴壁培养24 h后，更换成含有LPS的完全培养基继续培养24 h或HAMI3379预培养30 min。将BV-2分为6组：对照组、LPS(100 ng/mL)组、HAMI3379(0.01、0.1和1 μmol/mL)组、LPS+ HAMI3379组。

1.2.2 免疫荧光染色鉴定BV-2细胞：将BV-2细胞接种至24孔板，进行细胞爬片，置于恒温培养箱中培养24 h，弃去培养基，PBS洗2次，向各孔加入4%的多聚甲醛室温固定30 min，弃去固定液，PBS洗3次；加入0.5% Triton-X100室温透化30 min，弃去透化液，PBS洗3次；加入10%驴血清封闭30 min，去封闭液，加入Iba1山羊多克隆抗体(1∶300)，4 ℃过夜孵育；加入Cy3标记的驴抗山羊Ⅱ抗，37 ℃恒温培养箱中孵育1 h；DAPI染核液避光复染15 min，将盖玻片置于载玻片上，封片，荧光倒置显微镜拍照观察。

1.2.3 CCK-8法检测BV-2细胞的增殖率：取对数增殖期的BV-2细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度并接种至96孔板，5×103个/孔，置于培养箱中贴壁培养24 h；换成不含胎牛血清的DMEM培养16～18 h，然后按照实验分组，加入HAMI3379预培养30 min，换成含有LPS的培养基继续培养24 h；待培养结束，向各孔加10 μL的CCK-8溶液，置于培养箱中孵育1 h，用酶标仪测量各孔在450 nm处的吸光度A值，并计算细胞的增殖率。

增殖率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)

1.2.4 ELISA检测BV-2细胞上清液中细胞因子的水平：取对数增殖期的BV-2细胞接种至6孔板，5×104个/孔，置于培养箱中贴壁培养24 h；加入HAMI3379预培养30 min，换成含有LPS培养基继续培养24 h；收集细胞上清液，1 500 r/min离心15 min，取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行试验，检测上清液中IL-1β、TNF-α和IL-10的含量。

1.2.5 Western-blot检测PKCα、IKBα、NF-κB p50和p65蛋白的表达：取对数增殖期的BV-2细胞接种至6孔板，5×104个/孔，置于培养箱中贴壁培养24 h；加药处理24 h；待培养结束后，收集细胞，加入RIPA液裂解细胞，14 000 r/min离心10 min；取上清液，BCA试剂盒测量蛋白的浓度，取30 μg蛋白液与上样缓冲液(4∶1)混合，10%的SDS-PAGE分离蛋白，采用湿法转膜将目标蛋白转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2 h，孵育PKCα、IKBα、p50、p65、β-actin(1∶1 000)兔多克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜；辣根过氧化酶标记山羊抗兔Ⅱ抗，室温孵育1 h，ECL法化学发光；采用Image J软件对蛋白条带进行吸光度值分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BV-2细胞的培养及鉴定

BV-2细胞贴壁后，少部分呈分支状(图1A)；BV-2细胞经LPS激活后胞体变大变圆，轴突增加，呈阿米巴样 (图1B)；用小胶质细胞特异的Iba1抗体进行荧光染色，在荧光倒置显微镜下观察，细胞质呈红色荧光，细胞核被染成蓝色(图1C)。

2.2 HAMI3379对LPS诱导BV-2细胞增殖的影响

与对照组相比，LPS能够显著增加BV-2细胞的增殖率(P<0.05)；与LPS组相比，用HAMI3379预处理BV-2细胞30 min后，细胞的增殖率显著降低(P<0.05)，LPS+ HAMI3379 (1 μg/mL)对BV-2细胞增殖抑制作用最大(表1)。

A.morphology of adherent culture of BV-2 cells；B.morphology when BV-2 cells were activated；C.morphology of BV-2 cells were observed by immunofluorescence staining

图1 BV-2细胞的形态学观察和免疫鉴定
Fig 1 Morphological observation and immunological identification of BV-2 cells

表1 LPS和HAMI3379对BV-2细胞增殖的影响

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with LPS group.

2.3 HAMI3379对细胞上清液中炎性因子含量的影响

与对照组相比，LPS能够显著增加细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量，降低IL-10的含量 (P<0.05)；1μg/mL HAMI3379能够显著降低IL-1β的含量(P<0.05)。与LPS组相比，LPS+ HAMI3379组IL-1β、TNF-α的含量显著降低，IL-10的含量显著增加(P<0.05)(图2)。

2.4 HAMI3379对LPS诱导BV-2细胞中PKCα、IKBα、NF-κB p50、p65蛋白表达水平的影响

与对照组相比，LPS能够显著上调PKCα、IKBα、p65蛋白的表达(P<0.05)，但对p50蛋白的表达无显著性改变；与LPS组相比，HAMI3379+LPS组PKCα、IKBα、p50和p65蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05) (图3)。

3 讨论

正常情况下，小胶质细胞呈分枝状，细长的突起感受周围微环境变化，通过免疫监视、突触修剪及产生神经营养因子如BDNF、IGF-1调控神经元的分化和凋亡，维持中枢神经系统动态平衡。在脑缺血损伤后，小胶质细胞迅速活化，由分枝状变成阿米巴样，向损伤的中心区迁移，且释放大量的炎性因子如白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6及细胞间细胞黏附分子(intercellular cell adhesion molecule, ICAM)等，诱导炎性反应的发生，引起神经元的凋亡[8]。在该研究中，发现LPS刺激BV-2细胞24 h后，小胶质细胞的形态变为阿米巴样，呈激活状态。已有的研究发现，核转录因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)等信号通路参与了脑缺血损伤的发生过程[9]。NF-κB是脑缺血损伤后炎性反应发生的关键因子，脑缺血损伤发生后，NF-κB信号被激活并转移至细胞核，促进ICAM的表达及介导炎性因子的分泌。另有研究发现，LPS能够诱导BV-2细胞的激活，茴香醇通过下调NF-κB和JNK信号通路，抑制BV-2细胞的活化，产生抗炎作用[10]。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with LPS group图2 HAMI3379对细胞上清液中细胞因子释放的影响Fig 2 Effect of HAMI3379 on the release of cytokines in the n=3)

A.the relative protein levels of PKCα and p-PKCα; B.the relative protein levels of p50 and p65;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with LPS group

图3 HAMI3379对BV-2细胞中PKCα、IKBα、p50和p65蛋白的表达水平的影响

已有的研究证实，CysLT2受体介导了脑缺血损伤后炎性反应及神经损伤的调控。在氧和葡萄糖剥夺的星形胶质细胞中，CysLT1和CysLT2受体表达上调，CysLT1受体促进细胞的增殖，CysLT2受体介导细胞的凋亡[11]。另外，LPS与受体作用会诱导炎性反应的发生；在LPS刺激的BV-2细胞中，CysLT2受体的表达上调并转移至细胞核，促进炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的释放，诱导神经元的凋亡，沉默CysLT2能够逆转此结果[7]。在MACO法构建大鼠脑缺血损伤模型中，腹腔注射CysLT2拮抗剂HAMI3379能够减轻脑梗死体积，抑制炎性因子的释放，减轻神经元的损伤[12]。

本研究发现，LPS能够刺激BV-2细胞的活化，促进细胞的增殖，细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量显著增加，炎性和免疫抑制因子IL-10的分泌显著降低，且PKCα、IKBα和p65的表达也显著增加；采用CysLT2受体拮抗剂HAMI3379单独处理BV-2细胞，细胞因子TNF-α、IL-10的含量及p50、p65的表达改变均无统计学意义，但IL-1β的含量显著降低；HAMI3379预处理BV-2细胞30 min，再用LPS处理BV-2细胞24 h，HAMI3379能够显著抑制LPS诱导的细胞增殖，抑制细胞上清液中TNF-α、IL-1β的分泌，抗炎因子IL-10的分泌增加，且抑制PKCα、IKBα、p50、p65蛋白的表达；由此可知，LPS通过活化PKCα/NF-κB信号通路，促进炎性因子的释放，诱导炎性反应。

综上所述，HAMI3379能够抑制LPS诱导的小胶质细胞增殖，抑制促炎因子的释放；其作用机制是HAMI3379通过抑制PKCα/NF-κB信号通路的活化，抑制LPS与其受体的相互作用，发挥抗炎作用。