肠易激综合征患儿肠道菌群可促进小鼠肠道酸敏感离子通道蛋白的表达

赵军梅，袁丽萍，蔡 洁，李文亚，朱克然，桂 明

(安徽医科大学第一附属医院 儿科，安徽 合肥 230000)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一组以反复发作的腹痛或者腹部不适，伴有排便习惯及大便性状改变为主要特征的临床症候群。IBS的发生机制可能与遗传因素、环境因素、胃肠动力学异常、内脏高敏感性、黏膜和免疫功能异常、肠道微生物改变及精神心理因素[1]等相关。目前认为，肠道菌群失调与内脏感觉和胃肠道动力异常有密切关系[2]，并在IBS发病中发挥重要作用。但是肠道菌群参与胃肠道感觉和动力异常的机制尚未完全明确。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)是一类由细胞外酸化所激活的阳离子通道，由 4个功能基因编码 ,分别为ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4，与组织酸化与痛觉有直接关系[3-4]；ASIC3在炎性肠病[5]及腹型过敏性紫癜胃黏膜上呈高表达[6]，而ASICs的表达与肠道菌群的关系及其在功能性胃肠病发生中的调控作用尚未见报道。本研究探讨IBS患儿肠道菌群对小鼠ASICs表达的影响、ASICs表达与肠道微生物的关系及ASICs在肠道菌群-肠道感觉和动力异常中的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：20只SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量为16～18 g，6周龄(安徽省动物实验中心，动物许可证号SCXK-2017-001 )。

1.1.2 粪菌液的来源及制备：收集粪菌移植供体，6名健康志愿者粪便，男女各3名，年龄8～12岁，完全自发排便6～7次/周，Bristol评分3～4级，儿科门诊符合罗马IV诊断标准的IBS患儿的粪便，男女各3例，年龄8～12岁，Bristol评分级3～4级。参照文献[7]制备粪菌液。

1.1.3 主要试剂：山羊抗小鼠 ASIC1a、ASIC2和ASCI3(Santa Cruz公司)；多克隆抗体、二抗、SABC试剂盒( 武汉博士德生物技术有限公司)；MOT和Gas ELISA试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及处理：给小鼠25 mg链霉素连续灌胃3 d，构建伪无菌鼠模型[8]，随机分为两组：对照组予健康儿童粪菌液(0.2 mL/10 g)灌胃，实验组给予IBS患儿粪菌液(0.2 mL/10 g)灌胃，每日1次，连续3 d，以后隔天1次，共7次[9]。

1.2.2 肠道传输时间的测定：实验结束后次日，两组小鼠禁食不禁水16 h后，分别给予活性炭灌胃，20 min后眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠，迅速打开腹腔，仔细分离肠系膜，剪取上端自幽门，下至回盲部的肠管，将肠管不加牵引平铺于玻璃板上。用刻度尺测量小肠推进的距离，计算小肠推进率，小肠推进率%=活性炭推进距离(cm)/小肠总长度(cm)×100%。

1.2.3 血清胃动素(Motilin, MOT)和(Gastrin, Gas)的测定：按照ELISA法说明书，检测MOT和Gas的水平。

1.2.4 肠道黏膜病理改变及免疫组化法检测ASIC1a、ASIC2和ASIC3的表达：仔细分离小鼠的小肠和结肠，洗去内容物，分别于4%多聚甲醛中固定、石蜡包埋及HE染色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肠道菌群植入对小鼠胃肠动力的影响

实验组小鼠小肠活性炭推进率(%)为57.24±3.00，显著低于对照组的69.41±2.00(P<0.05)。

2.2 肠道菌群植入对小鼠血清中MOT和Gas分泌的影响

实验组小鼠血清中的MOT和Gas水平明显下降(P<0.05)(表1)。

表1 血清中MOT和Gas表达水平

*P<0.05 compared with control group.

2.3 小鼠小肠和结肠黏膜的病理变化

实验组小鼠小肠及结肠壁较薄，黏膜上皮完整，腺体排列稍紊乱，结肠上皮细胞间紧密连接结构稍模糊，有较多炎性细胞浸润；对照组小鼠小肠及结壁正常，黏膜上皮完整，腺体排列整齐，无或仅有少量炎性细胞浸润(图1)。

2.4 肠道菌群植入对小鼠小肠和结肠ASIC1、ASIC2和ASIC3表达的影响

实验组小肠和结肠ASIC3表达较对照组明显增多(P<0.05)；但是两组小鼠小肠和结肠中均未见ASIC1和ASIC2表达(图2，表2)。

2.5 肠道组织ASIC3表达量与小肠推进率的关系

小肠及结肠组织ASIC3表达增加与小肠推进率降低显著相关(P<0.05)(图3)。

A,B.the HE staining of small intestinal mucosa in control group and IBS group, respectively；C,D.the HE staining of colon mucosa in control group and IBS group, respectively

图1 小肠和结肠黏膜HE染色
Fig 1 HE staining of small intestinal and colon mucosa(×400)

A1, B1.the ASIC1 expressions of small intestine in control group and IBS group, respectively；C1,D1.the ASIC1 expressions of colon in control group and IBS group, respectively；A2,B2.the ASIC2 expressions of small intestine in control group and IBS group, respectively；C2,D2.the ASIC2 expressions of colon in control group and IBS group, respectively；A3,B3.the ASIC3 expressions of small intestine in control group and IBS group, respectively；C3,D3.the ASIC3 expressions of colon in control group and IBS group, respectively

图2 小肠和结肠中ASICs表达
Fig 2 ASICs expression of small intestine and colon(×300)

表2 ASICs在小肠和结肠上的表达Table 2 ASICs expression in small intestine and colon(A value, n=10)

*P<0.05 compared with control group.

图3 肠道ASCI3与小肠推进率的关系Fig 3 Relationship between intestinal ASCI3 and intestinal propulsion rate

3 讨论

肠道微生物失衡与IBS发生密切相关，IBS患儿肠道微生物发生的变化与其临床症状相关。肠道微生物异常显著影响肠道动力，且肠道微生物大多通过其代谢产物影响肠道动力[10-11]。本研究发现，用IBS患儿的粪菌液处理的小鼠小肠推进率降低，说明肠道菌群改变能够引起肠道的动力学变化，与文献报道一致[10-11]。胃肠激素在肠道动力学中发挥重要作用，MOT属消化间期激素，其生理功能是促进消化道运动，加速胃排空，对胃肠运动尤其消化间期移行复合运动有调节作用；Gas主要促进胃酸分泌和胃窦收缩；促进胃蛋白酶和内因子分泌，对胃黏膜细胞有营养及增殖作用。本研文发现，IBS肠道微生物植入后小鼠血清中MOT和Gas的表达量明显下降，进一步证明肠道菌群在小鼠肠道动力改变中发挥了重要作用。但是肠道菌群改变胃肠动力学的机制尚不明确。

ASICs 是一类由细胞外酸化直接激活的阳离子通道，在胃肠道内广泛分布并参与胃肠道炎性痛反应及机械压力信号传导。ASIC3在炎性肠病肠黏膜上表达增加，ASICl基因敲除的小鼠对食管机械扩张刺激敏感性增高，并伴有胃排空延迟[12]，ASIC2敲除可以影响胃肠道不同类型的机械压力感受器，减少胃肠道的机械敏感性。本研究发现实验组小鼠小肠和结肠上皮细胞中ASIC3的表达明显增加。正常的肠道呈弱碱性，肠道微生物在维持这种弱碱性环境进而保持肠道正常功能中发挥重要作用。一旦肠道微生态失衡，这些微生物通过分解代谢影响胃肠道功能。IBS患者肠道中乳酸杆菌和韦荣球菌增多，导致IBS患者肠道中短链脂肪酸如乙酸、丙酸和总有机酸水平升高[13]，短链脂肪酸的升高在一定程度上能够导致肠道环境酸化。ASIC3 在pH 6.7～7.1时即可被激活[14]，是所有ASICs亚基中对PH变化最敏感的；而ASIC1和ASIC2分别在pH 4.35和pH 6.0时才能被激活[15]。因此，本研究中发现的肠道ASIC3的激活可能与肠道微生物失衡导致的肠道pH降低有关。本研究还发现ASIC3表达增加与肠道动力降低有着显著的相关性，说明ASIC3的激活可能与肠道动力改变有关。

综上，肠道微生态失衡可以导致肠道动力降低，ASIC3激活在肠道微生物-胃肠动力异常中起着一定作用，其具体机制需进一步研究。