白芨多糖抑制溃疡性结肠炎大鼠炎性反应与氧化应激

黎笑兰，张新广，尹少萍

(1. 东莞市人民医院 药剂科，广东 东莞 523059； 2. 东莞市厚街医院 药剂科 广东 东莞 523900)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性炎性结肠疾病，主要表现为弥漫性黏膜炎性反应、腹泻和黏液脓血便等[1]。UC的发病率逐年升高，但其发病机制尚不明确[2]。临床上，西医治疗UC取得了一定的疗效，但仍存在较多的不良反应，且复发率高[3]。寻找较好疗效且毒副作用少的药物成为UC药物研究的重要方向。中医药治疗UC具有明显的优势，在UC的药物开发和治疗上取得了显著的进展[4]。白芨是一种传统中药，具有保护肠黏膜和促进溃疡组织愈合的功效，多糖是白芨的主要化学成分之一，其对UC具有较好的疗效，可促进UC小鼠黏膜修复、抑制炎性反应和恢复免疫平衡[5]。本研究将探讨白芨多糖对UC大鼠的治疗效果及其作用机制，以期为UC的药物研发和临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠50只，体质量(180±20)g[湖南嘉泰实验动物有限公司提供，合格证编号为：SCXK(湘)2015-0006]。

1.1.2 材料：白芨药材(安徽信远中药科技有限公司)；三硝基苯磺酸(Sigma-Aldrich公司)；苏木精染液、伊红染液(碧云天生物技术有限公司)；白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(Elabscienc公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Trizol试剂、反转录试剂盒和SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗Toll样受体-4(Toll-like receptors 4，TLR-4)多克隆抗体、兔抗核转录因子-κB(NF-κB)p65多克隆抗体和兔抗GAPDH单克隆抗体(Cell Signaling公司)；PVDF膜和化学发光试剂(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 白芨多糖的提取：依据参考文献[6]，采用硫酸苯酚法测得多糖含量为(84.76±5.13)%，储存于干燥环境中备用。

1.2.2 大鼠的分组及模型制备：将大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪和白芨多糖低、中、高剂量干预组，每组10只。用戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，从肛门插入至距肛门8 cm处，注射器缓慢注入0.8 mL含50%乙醇的三硝基苯磺酸(2.5 mg/mL)[7]。正常组进行等量的0.9%氯化钠溶液灌肠处理。造模2 d后开始分组给药治疗，药物组给予美沙拉嗪10 mL/kg灌胃；白芨多糖低、中、高剂量组分别给予100、200和400 mg/kg灌胃；正常组和模型组给予等量的蒸馏水灌胃。1次/d，连续给药10 d。给药结束后，禁食24 h，腹主动脉取血。颈椎脱臼处死大鼠，距离肛门8 cm处收集结肠组织。

1.2.3 疾病活动指数(disease activity index，DAI)的评分：给药期间，记录大鼠体质量、粪便及便潜血情况，对大鼠进行DAI评分，评分指标参考文献[4]。DAI=(体质量指数+大便形状+便血情况)/3。

1.2.4 ELISA检测血清IL-1β、IL-10和TNF-α水平：按照ELISA试剂盒说明进行。

1.2.5 RT-qPCR检测结肠组织IL-1β、IL-10和TNF-α mRNA表达：提取组织总RNA，将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行RT-qPCR扩增。引物序列如下：IL-1β上游引物：5′-TGCCACCTTTT GACAGTGATG-3′，下游引物：5′-AAGGTCCACGGG AAAACAC-3′；IL-10上游引物：5′-AAGCTTAACGCG TAATTGG-3′，下游引物：5′-CCGTATGTGCCATGCGT AGCG-3′；TNF-α上游引物：5′-ATGGCCTCCCTCT CATCAGT-3′，下游引物：5′-TTTGCTACGACGGTG GGCTAC-3′；内参β-actin上游引物：5′-TGGAAGG TGGACAGTGAG-3′，下游引物：5′-GAGGGAAATC GTGCGTGAC-3′。

1.2.6 检测结肠组织SOD、MDA和GSH-Px：结肠组织于冰上剪碎后，制成组织匀浆。3 000 r/min离心10 min，按照试剂盒说明进行。

1.2.7 Western blot检测结肠组织TLR-4和NF-κB p65蛋白表达：提取结肠组织总蛋白，测定蛋白浓度后，取20 μg上样，SDS-PAGE分离，将蛋白转印至PVDF膜上，室温封闭2 h。加入一抗稀释液(稀释比1∶1 000)，室温孵育1 h，洗膜，加入二抗稀释液(稀释比1∶2 000)，室温孵育1 h。洗膜，加入化学发光试剂，于暗室中显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 白芨多糖对UC大鼠模型DAI评分的影响

与正常组比较，UC模型组大鼠体质量明显下降，DAI评分明显升高(P<0.05)。经过白芨多糖治疗后，大鼠体质量逐渐升高，DAI评分降低，与模型组比较差异明显(P<0.05)(表1)。

表1 体质量和DAI评分比较

*P<0.05 compared with normal group;#P<0.05 compared with model group.

2.2 白芨多糖对UC大鼠IL-1β、IL-10和TNF-α的影响

UC模型组大鼠结肠组织中IL-β和TNF-α mRNA表达水平及在血清中的浓度明显低于正常组，而IL-10降低(P<0.05)。与模型组比较，白芨多糖低、中、高剂量组的IL-β和TNF-α mRNA表达水平及在血清中的浓度明显降低，而IL-10表达及浓度呈剂量依赖性升高(P<0.05)(表2，3)。

表2 结肠组织中IL-1β、IL-10和TNF-α mRNA水平比较

*P<0.05 compared with normal group;#P<0.05 compared with model group.

表3 血清中IL-1β、IL-10和TNF-α浓度比较

*P<0.05 compared with normal group;#P<0.05 compared with model group.

2.3 白芨多糖对结肠组织中SOD、MDA和GSH-Px的影响

与正常组比较，UC模型组大鼠SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，白芨多糖低、中、高剂量组SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量呈剂量依赖性降低(P<0.05)(表4)。

表4 结肠组织中SOD、MDA和GSH-Px水平比较

*P<0.05 compared with normal group;#P<0.05 compared with model group.

2.4 白芨多糖对结肠组织TLR-4和NF-κB p65蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中TLR-4和NF-κB p65蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较，白芨多糖低、中、高剂量组结肠组织中TLR-4和NF-κB p65蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.05)(图1，表5)。

图1 Western blot检测结肠组织中TLR-4、NF-κBp65蛋白表达Fig 1 Proteins expression of TLR-4 and NF-κB p65 in colon tissues were detected by Western blot

表5 结肠组织中TLR-4和NF-κB p65蛋白表达水平比较

*P<0.05 compared with normal group;#P<0.05 compared with model group.

3 讨论

目前认为促炎因子与抗炎因子之间的失衡导致的免疫系统紊乱是引起UC发生的重要内在因素之一。本研究发现不同剂量的白芨多糖可降低UC大鼠血清IL-1β、TNF-α的浓度及结肠组织中mRNA表达水平，但IL-10水平显著升高。IL-1β是一种促炎性细胞因子，可激活多种免疫和炎性细胞，在UC小鼠血清及组织中的表达显著高于正常小鼠[8]。TNF-α是机体免疫应答和炎性反应的重要调节因子，可趋化炎性细胞，促进肠道上皮细胞凋亡，参与了UC炎性反应的发生发展[9]。IL-10是典型的抗炎因子，肠道组织中IL-10降低与慢性肠道炎性反应的发生有关[10]。

TLR4是Toll样受体家族中的主要成员，是一种跨膜受体蛋白，位于细胞外的结构域识别病原体，细胞内的结构域参与信号通路传导[11]。TLR4通过激活下游信号传导分子活化NF-κB，从而调控炎性因子表达，TLR4/NF-κB信号通路在三硝基苯磺酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型中过度表达[12]。本研究发现白芨多糖可明显降低UC大鼠结肠组织中TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平，提示白芨多糖可通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制UC大鼠炎性反应。

氧化应激反应是UC发病的另一重要因素，UC可产生大量的氧自由基，可引起脂质过氧化，导致MDA含量升高，故MDA水平可反映细胞受损[13]。当体内氧自由基增多时，可产生自由基清除剂SOD来清除氧自由基，因此，SOD活性水平可间接反映机体组织的损伤程度[14]。GSH-Px可通过清除MDA和活性氧脂质过氧化物起保护组织膜结构和功能的作用[15]。本研究显示，经过白芨多糖治疗后，UC大鼠MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性明显升高，提示白芨多糖可抑制UC大鼠氧化应激反应，从而保护结肠组织。

综上所述，白芨提取物多糖可能是通过抑制大鼠炎性反应及氧化应激抑制UC。