外泌体microRNAs与阿尔茨海默病关系的研究进展

刁华琼，李小黎，林亮吟，刘海鹏，陈弘婧，丁海月，魏 丹

(1.北京中医药大学， 北京 100029; 2.北京中医药大学第三附属医院 脑病科，北京 100029)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,早期主要表现为记忆力、计算力、认知功能减退等症[1]。国际阿尔茨海默病协会(Alzheimer’s disease international，ADI)2018年公布数据，全球痴呆人数达5 000万，2050年预计突破1.3亿，其中2/3以上为AD患者[2]，AD是老年期最常见的痴呆类型。随着中国人口老龄化程度持续加深，AD患者给社会带来的经济负担日益沉重。据统计，2015年中国AD患者的社会经济费用总额约为1 677.4亿美元，是2006年“世界老年痴呆症报告”中估计的5.95倍[3]。如何更好的防治AD已成为神经精神科研究的热点。

目前尚不完全明确AD的发病机制，普遍认为与β淀粉样蛋白(beta-amyloid peptide,Aβ)的生成与清除失衡及Tau蛋白的过度磷酸化有关，其病理学典型改变包括神经炎性斑(neuritic plaques， NP)、 神经纤维缠结(neurofibrillary tangle， NFT)、 神经元缺失和胶质增生等[1]。常用治疗AD的乙酰胆碱酯酶 (acetycholine esterase, ACHE) 抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受体拮抗剂仅为对症用药，并不能逆转或终止AD的病理进程。截至2018年4月，已有超过1 000个针对Aβ和Tau蛋白的新药研究在临床试验的不同阶段宣告失败[4]，AD的治疗是国际公认的医学难题。近年大量研究表明外泌体可调节Aβ的沉积及Tau蛋白的磷酸化，特定miRNAs通过外泌体运输可穿过血脑屏障，减轻AD的临床症状[5-8]。本文通过整理相关文献，旨在回顾外泌体miRNAs与AD关系近年的研究进展，总结并提出相关问题及建议。

1 外泌体miRNAs的来源

外泌体是多囊泡体(multivesicularbodies，MVBs)与质膜融合后形成的40～100 nm的膜性囊泡，其携带的miRNAs为非编码蛋白的小RNA分子，具有明显的细胞间信息传递功能，与AD、帕金森病(Parkinson’s disease，PD) 等[9]多种神经系统疾病的发生发展相关。外泌体miRNAs可在脑脊液、血液、尿液等体液中检出。脑脊液被认为是AD生物标志物的最佳来源，但腰椎穿刺属侵入性操作，存在局麻药过敏及颅内感染等风险。采取外周血不仅操作简便，感染风险较小，而且血浆中外泌体miRNAs表达丰富，稳定性较高[10]，增加了其作为诊断AD生物标志物的可行性及试验的可重复性。近年研究发现基于适体的荧光偏振测定(AFPExo测定)法及荧光纳米颗粒WO2002/088706试剂盒均能用于血浆外泌体miRNAs表达谱的检测[11-12]。前者检测的灵敏度高，约30 min可出结果，后者较传统方法FISH(荧光原位杂交)和ELISA(酶联免疫吸附测定)所需的实验成本较低，外泌体miRNAs的检测方法得到了进一步完善。

2 外泌体miRNAs与AD发病

2.1 外泌体miRNAs与APP

淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是Aβ形成的前体蛋白，受外泌体miRNAs剪接影响。健康人脑以APP695表达为主，当特定miRNAs广泛缺乏时，APP695的表达下调，Aβ生成增多[13]。APP 3′非翻译区(untranslated region，UTR)是miRNA靶向调控APP表达的关键区域，外泌体miR-101-3p、miR-153-3p等可通过结合APP 3′UTR抑制APP在人脑细胞中的表达，而上述miRNAs在AD患者脑中表达下调[14]。此外，miRNAs可通过特定的单核苷酸多态性(single nucleotide polymor-phism，SNP)影响APP的转录和转录后表达。在用APP-118C/A CC，CA和AA基因型质粒转染的HeLa细胞中，miR-101-3p、miR-144-3p、miR-153-3p和miR-381-3p转染的APP分别在CA、AA基因型质粒中检测出最高和最低水平[5]，APP 3′UTR区域中-118C/A位点的遗传变异可影响miRNA对APP表达的调节。

2.2 外泌体miRNAs与Aβ、Tau蛋白

β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)的生成与清除失衡致使Aβ沉积是阿尔茨海默病病理损伤的始动因素，可促使NP形成[1]。外泌体相关蛋白Alix在AD患者脑切片淀粉样斑块中呈现特异性聚集，而健康人基本不存在，提示Aβ可能受外泌体影响[6]。NFT是Tau蛋白过度磷酸化的结果，最早出现在内嗅皮质和海马区，miR-181c-5p的血清表达下降与血浆Aβ水平升高、左内嗅皮质体积减小有关[7]，外泌体miR-138通过视黄酸受体α/糖原合成酶激酶-3β(RARA/GSK-3β)途径，可促进N2a细胞中的Tau蛋白磷酸化[8]，加速NFT形成。进一步说明了miRNAs与Ap、Tau蛋白的关系。

3 外泌体miRNAs与AD的早期诊断

AD的亚临床潜伏期可长达20余年，在出现明显的临床症状及影像学改变前，AD患者大脑海马区可能已存在相关的病理变化，探索早期诊断AD的生物标志物具有重要意义。有学者指出：脑脊液(cerebrospinnal fluid，CSF)中Aβ1-42、T-Tau和磷酸化Tau蛋白浓度是AD临床实践和研究中广泛使用的诊断标志物，且以上标志物在脑脊液及外周血中对诊断AD的价值一致[15]，外周血作为相关标志物来源具有可行性。

大脑神经元发生病变、凋亡后，其产生的外泌体miRNAs可通过血脑屏障被释放到血液中，研究证明AD组与对照组血浆中外泌体miRNAs常存在差异。AD患者外周血中miR-9-5p和miR-598较健康受试者高[16],miR-135b较健康受试者低[17]，主观认知障碍(subjective cognitive decline，SCD)、痴呆期(dementia of Alzheimer type，DAT)和MCI(mild cognitive impairment，MCI)患者血清外泌体内miR-193b水平均较健康对照组低, 且DAT组低于MCI组，MCI组低于SCD组[18]，外泌体miRNAs水平可随AD病程进展而变化，但尚不明确外泌体miR-193b水平在AD患者脑中的变化情况。

4 外泌体miRNAs与AD的治疗

4.1 抑制Aβ、Tau蛋白水平

病理状态下，APP由β-分泌酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE)和γ-分泌酶分解，产生具有神经毒性的Aβ42。过表达的miR-22-3p可靶向并调节促分裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)，抑制Aβ42水平，改善小鼠的空间记忆力[19]。β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1)是Aβ产生的关键限速酶，神经细胞中外泌体miR-186[20]可直接结合BACE1基因的3′UTR，减少Aβ生成。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是参与Tau蛋白磷酸化的主要激酶，miR-124-3p可靶向微囊蛋白1(caveolin-1)，通过caveolin-1-PI3K/Akt/GSK3β途径，抑制Tau蛋白过度磷酸化[21]。此外，通过无创鼻腔给药，miR-146a agomir(M146AG)可改善APP/PS1转基因小鼠的认知障碍，并减轻AD小鼠模型Aβ沉积和海马中的Tau磷酸化[22]。遗憾的是，目前尚不能够证实外泌体miRNAs可调节Aβ的清除机制。

4.2 拮抗神经毒性

AD的发生发展伴随着慢性炎性反应过程。小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫细胞，在AD的病程中可被广泛激活，表达出致神经元损伤的肿瘤坏死因子α(TNF-α)。研究发现，N2a细胞中的miR-137可通过抑制TNF-α诱导的蛋白表达，降低Aβ诱导的神经毒性[23]；快速老化SAMP8小鼠中miR-135b可靶向BACE1，增强海马细胞的增殖，促进小鼠学习和记忆能力恢复[16]，具有神经保护作用。另外，miR-132的两个关键靶点PTEN和FOXO3a在AD脑中均被上调，褪黑素可通过miR-132/PTEN/AKT/FOXO3a途径在Aβ诱导的神经毒性中发挥其神经保护作用[24]。

4.3 作为新型运输载体

血-脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)选择性地调节各种物质的渗透性以保持中枢神经系统内环境的稳定，虽是人体的保护性屏障，但药物成分不易通过BBB成为治疗AD的另一难题。研究发现，姜黄素具有抗氧化、抗感染作用，经特定外泌体运输穿过血脑屏障后可抑制AKT/GSK-3β相关的Tau蛋白磷酸化，改善AD大鼠的认知功能[25]。此外，外泌体可运输miR-124促进脑损伤后小胶质细胞M2极化，改善海马神经功能恢复[26]，其有望成为治疗AD的新靶标。

5 问题与展望

外泌体miRANs与AD的关系具有良好的研究前景，深入研究外泌体miRNAs与APP、Aβ、Tau蛋白的关系可加深对AD发病机制的认识。从已有的试验数据中可归纳出数十种与AD相关的外泌体miRNAs，但其对于诊疗AD是否具有特异性尚不明确。可尝试增加试验样本量，统一试验操作标准，深入研究特异性外泌体miRNAs对AD的诊疗意义。现有关外泌体miRNA作为AD生物诊断标志物的研究样本多采自外周血，外泌体可运输miRNAs穿过血-脑屏障减轻AD症状具有一定的创新性及优势。目前尚不知血液、脑脊液及脑组织中其他物质交换是否会受此影响而产生病理变化，其安全性有待考证。此外，中医药辨证治疗AD亦能取得显著的临床疗效，已知姜黄素可通过血浆外泌体运输穿过脑屏障抑制Tau蛋白磷酸化，可进一步研究常用治AD的中药如葛根、五味子、银杏叶制剂等，是否也通过影响外泌体miRNAs表达而减轻AD临床症状，拓展AD的诊疗思路。