1例利福平rpoB基因多个位点缺失引起的耐药分析 *

王明栋，秦 万△，夏凤琼，欧维正，张 娟，徐 勇，杨儒斌

1.贵州省贵阳市公共卫生救治中心检验科，贵州贵阳 550003；2.贵州省骨科医院检验科,贵州贵阳 550004

耐药结核病的流行使当前结核病的控制工作面临着严峻的挑战。研究发现，结核病初治耐药的形成一方面与结核分枝杆菌的基因变异有关，另一方面是健康人被复治的耐药患者携带的结核分枝杆菌传染所致，而复治耐药结核病患者的出现则与用药史有很大关系[1]。利福平通过与由rpoB基因编码的RNA聚合酶亚基特异性结合，阻断结核分枝杆菌RNA的合成，导致结核分枝杆菌的死亡[2]，从而达到治疗目的。rpoB基因在结核分枝杆菌基因组中只有1个拷贝，它含有3 534 bp的开放读码框，当507～533位27个氨基酸密码子的81个碱基的RRDR区发生突变(包括点突变或短的插入、缺失突变等)时，使DNA依赖的RNA聚合酶活性下降，利福平与RNA聚合酶亚单位结合力减弱，从而发生细菌对利福平的耐药[3]。有关研究报道，95%或更高比例的利福平耐药株的rpoB基因突变位于此区域[4]。贵阳市公共卫生救治中心于2019年1月26日收治1例肺结核复治病例，痰液核酸检测结果为结核分枝杆菌阳性，然后进行耐药基因芯片扫描检测rpoB基因，显示为511位点信号值极低、513位点和516位点无信号值，高度怀疑为缺失，异烟肼结果敏感。为进一步明确rpoB基因是否存在多个位点缺失，本研究进行第一代基因测序，现就该患者出现的rpoB基因多位点缺失及治疗欠佳的原因进行分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者，男，19岁，厨师，身高172 cm，体质量49 kg，近1年来体质量明显减轻。主诉：间断咳嗽1年，再发7个月，加重1个月。患者出生并生活于原籍，近期未到过其他疫区。既往有吸烟史3年，每天至少40支，现已戒烟近1年；既往有饮酒史3年，以啤酒为主，每周3～4次，每次4～6瓶，已戒酒近1年。1年前患者无明显诱因出现咳嗽，呈阵发性，咳少许黄白色黏液痰，偶有间断痰血，痰多血少、色鲜红，伴乏力、食欲缺乏、盗汗、活动后气促气喘，平路步行100 m感气促气喘。初期以“感冒”治疗，无效后于当地医院诊断为肺结核，予瓶装异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇(HRZE)抗结核治疗1个月后症状明显好转，便自行停药。7个月前患者无明显诱因再次出现以上症状且有加重情况，故又到当地医院就诊，完善相关检查后诊断为肺结核复治，仍以上述抗结核药物治疗，但咳嗽、咳痰症状易反复，呈逐渐加重趋势，咳嗽剧烈及深呼吸时感双侧胸痛，呈阵发性钝痛，以右侧为主。患者再一次就诊于当地医院，怀疑为耐药肺结核，后转入贵阳市公共卫生救治中心治疗。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Gene Xpert MTB/RIF)检出痰液中有结核分枝杆菌并对利福平耐药，故以耐药肺结核收治于结核科。实验室检查：血生化腺苷脱氨酶(ADA)为28.7 U/L；结核抗体IgG阳性；红细胞沉降率28 mm/h。B超：右侧胸腔少量包裹性积液。胸部CT：右侧胸廓塌陷，右侧胸壁见宽基底弧形影，内见液平面形成，边缘清，局部见胸膜反应；右上叶支气管壁增宽、增厚呈“双轨征”。病原菌检查：痰抗酸染色阳性；分枝杆菌核酸检测阳性。入院治疗8 d后临床症状稍有好转，但因经济原因患者要求出院。后期追踪出院6个月服药及治疗情况：结核临床症状仍有，药物治疗欠佳。

1.2仪器与试剂 DNA微阵列芯片试剂由北京博奥生物技术有限公司提供；10% NaOH液化液由PCR实验室自配； ExtractorTM36核酸快速提取仪，BioMierTMⅡ芯片杂交仪，SlidewasherTM8芯片洗干仪和LuxSCan-10K/B微阵列芯片扫描仪均由北京博奥生物技术有限公司提供；95 ℃ K30干式恒温仪由上海之信仪器有限公司提供；BY-G18型医用高速离心机由北京白洋淀医疗器械有限公司提供；TC-96/G/H(b)基因扩增仪由杭州博日科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1DNA微阵列芯片法 DNA微阵列芯片法检测指标包括利福平及异烟肼的3个耐药相关基因rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子的野生型及不同突变型。其中对于利福平耐药相关基因rpoB基因检测6个位点，以及531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG这13种突变型。对于异烟肼耐药相关基因katG基因及inhA基因启动子各检测1个位点，分别为katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC两个突变型，inhA基因启动子15位C→T突变型。

1.3.2罗氏培养 接种后的改良罗氏培养基置于37 ℃培养5～8周，每周观察1次细菌的生长状态直至有菌落生长到对数生长期(细菌生长最旺盛时期)为佳。

1.3.3表型药敏试验 本研究采用表型药敏试验(比例法)，按照中国防痨协会基础专业委员会制订的《结核病诊断实验室检验规程》[5]进行试验。

2 结 果

2.1DNA微阵列芯片法测序结果 将DNA微阵列芯片法扫描判读结果为疑似rpoB基因多个位点缺失(rpoB 511、513与516)的标本包装后送至北京博奥生物技术有限公司进行rpoB基因一代测序，结果显示为513～516位点缺失，其中513位点的碱基AA缺失，514位点的碱基TTC缺失，515位点的碱基ATG缺失，516位点的碱基G缺失。同时发现在第190～242个碱基有1个碱基也出现缺失，这可能与耐药相关位点无关。异烟肼扫描结果判读为敏感。

2.2罗氏培养与药敏试验结果 送检了清晨痰进行结核分枝杆菌培养(罗氏培养)，结果为阳性。菌株的表型药敏试验(比例法)结果为对利福平(4.0 μg/mL)和异烟肼(0.4 μg/mL)耐药，对链霉素(10.0 μg/mL)、乙胺丁醇(2.0 μg/mL)、氧氟沙星(2.0 μg/mL)和卡那霉素(10.0 μg/mL)均敏感。

3 讨 论

为了验证利福平rpoB基因多个位点的缺失对利福平耐药程度的影响，对该菌株进行了表型药敏试验(比例法)，结果显示，其对利福平(4.0 μg/mL)和异烟肼(0.2 μg/mL)耐药，其余均敏感，但值得一提的是，耐药菌株生长缓慢，这就证实了耐药基因缺失而导致利福平不同程度的耐药。同时利福平rpoB基因多个位点的缺失也会影响其他抗结核药的耐药性，故导致耐药菌株生长缓慢，这可能是低耐药性的表现。李敏等[6]报道，rpoB基因不同位点的突变导致的耐药水平是不同的。而本研究主要通过利福平rpoB基因测序后证实患者对利福平耐药是由于rpoB基因的513～516位点的缺失，其中513位点及516位点是利福平耐药的相关位点，这几个位点的缺失是导致利福平不同程度耐药的原因，然而是否会导致其他抗结核药的不同程度耐药还需要大样本的研究证实。但就本案例的治疗情况来说，利福平rpoB基因这几个位点的缺失可能导致其他抗结核药耐药，从而导致治疗效果欠佳。

本研究中患者出现耐药基因缺失而导致不同程度耐药性的可能因素为该患者职业为厨师，经常吸入油烟，这在一定程度上加重了肺清除功能的负荷，给了结核分枝杆菌感染的机会，同时患者有饮用啤酒史而且吸烟量比较大。吸烟是肺结核发病的危险因素，吸烟者肺结核发病风险是非吸烟者的5倍[7]。以上这些因素可导致患者免疫力的降低，在被结核分枝杆菌感染后有可能发生rpoB基因位点缺失。复治患者是指因结核病不合理或不规律治疗超过1个月的患者、初治失败和复发患者。该患者于1年前便出现肺结核的症状，并被当地医院诊断为肺结核，后给予瓶装HRZE抗结核治疗1个月后症状明显好转，于是患者便自行停药，但在数月后，患者又出现了原有症状且有加重趋势，在继续给予HRZE抗结核治疗无效的情况下才就诊。该例患者依从性差，这种不遵医嘱的服药方式也有可能是导致耐药的原因，或者也是耐药基因突变及位点缺失的原因。这与袁磊凌等[1]报道的佛山市涂阳肺结核患者耐药情况分析中的耐药因素相符。全国第5次结核病流行病学调查显示，我国西部地区的肺结核患病率明显高于中、东部地区，贵州省是经济欠发达的西部省份，疫情严重[8]。患者生活于高疫情的环境下，其也有可能是被因基因位点缺失而产生耐药菌株的其他患者传染所致。

DNA微阵列芯片法检查结果显示，异烟肼敏感，而表型药敏试验(比例法)中异烟肼结果为耐药。对于结果不一致的可能原因如下：(1)结核分枝杆菌表型药敏试验(比例法)是通过对比、观察结核分枝杆菌在含药和不含药的培养基中的生长情况来检测其耐药性，而DNA微阵列芯片法中只有部分抗结核药物特异的耐药相关突变基因被发现，目前的耐药基因检测试剂也只能检测已发现的抗结核药物主要耐药基因型。(2)DNA微阵列芯片法无法确定标本中耐药细菌的比例，可能难以检出野生型和突变型菌株混合形成的异质性耐药(即从患者体内同时分离出敏感菌株和耐药菌株的现象)，也可能无法检出表型药敏试验耐药水平的耐药菌株。(3)与异烟肼耐药相关的katG基因和inhA基因启动子存在其他未知的耐药相关位点。

综上所述，对于药物治疗效果欠佳或失败的肺结核患者，广大医务人员应高度重视，随时监测药物敏感性，同时还要注意类似基因突变或缺失而导致的其他抗结核药耐药。对于依从性差者,医务人员及家属要加强监督管理,确保患者在整个治疗过程中规律用药。