大豆异黄酮防治肝癌作用机制研究进展

杨潇，周晓，孔连宝

(1.南京医科大学第一临床医学院，南京 210000； 2.南京医科大学第一附属医院肝胆中心，南京 210000)

大豆异黄酮(soybean isoflavones，SIF)又称植物雌激素，是一种从大豆中提取的天然化合物，主要存在于大豆胚轴中，由大豆生长过程中的次生代谢产生[1]。SIF以游离型糖苷配基及结合型糖苷两种形式存在于自然界中，已知的游离型SIF主要有3种，除大豆黄素及大豆苷元外，另一种具有广泛生物学活性及抗肿瘤作用的为染料木黄酮，又称金雀异黄素、染料木素，约占SIF总含量的60%[2]。目前已知的SIF的生物活性功能包括心血管保护、免疫调节、类雌激素样作用、延缓神经退行病变、降低血糖、治疗骨质疏松及抗肿瘤作用，其中SIF的抗肿瘤作用是研究热点[2]。流行病学调查结果表明，SIF作为人体所需的一种重要营养素，其摄入水平与多种癌症的发生率呈负相关，其中包括肝癌[2]。随着SIF治疗直肠癌、乳腺癌及前列腺癌等肿瘤作用途径及机制的逐步明确，其在防治肝癌方面可发挥重要作用。现从保护肝细胞、预防肝细胞癌变、抑制肝癌细胞生长、诱导肝癌细胞凋亡、防治肝癌复发转移及与其他肝癌治疗药物协同作用等方面阐述SIF防治肝癌的作用机制，就SIF在抗肝癌作用机制方面的研究进展予以综述，以期为发现新的抗肝癌药物提供更多的理论依据。

1 保护肝细胞的作用

许多危险因素可以导致肝细胞癌变，其中以慢性病毒性肝炎、饮酒、非酒精性脂肪肝最常见[3]。因此，减轻各种危险因素对肝细胞的损害是防治肝癌的关键。肝炎病毒感染后肝损伤动物模型的建立较困难，而运用化学制剂及射线辐照可以有效模拟肝炎损伤的疾病模型，明确促使肝脏癌变的作用机制，并可在SIF干预过程中，对SIF保护肝细胞的作用机制进行研究。杜奥博等[4]和尹学哲等[5]通过建立四氯化碳模拟诱导小鼠肝脏细胞急性损伤模型发现，提高肝脏抗氧化酶、线粒体Ca2+，Mg2+-ATP酶及还原型谷胱甘肽活性可减少氧自由基及脂质过氧化反应产物丙二醛的产生，降低线粒体氧化应激及DNA损伤，减轻肝细胞因生物膜脂质过氧化造成的结构功能损害及代谢障碍，从而对肝细胞起保护作用[6]。持续的炎症反应造成肝细胞的损害累积，从而促进肝细胞恶变及肿瘤的进展[7]。曾珊等[8]实验发现，SIF可以有效减弱γ射线辐照小鼠肝细胞造成的DNA断裂及染色体畸变等不可逆性损害，其作用途径也与SIF提高肝细胞抗氧化酶活性、增强其协同作用、减少氧自由基生成有关。上述抗氧化酶活性具有明显的SIF剂量依赖性，随着SIF剂量的改变，不同种类抗氧化酶将被激活，并发挥其特定的作用[9]。此外，SIF自身也具有抗氧化作用，可参与清除氧自由基，并可出现反馈性抑制超氧化物歧化酶活性的现象[8,10]。由此可见，SIF具有肝细胞保护功能，但在不同剂量和时间作用下，SIF发挥作用的途径及机制均不相同，因此准确把控SIF的安全剂量及作用时间是目前研究的主要难题。

由于肝脏是脂质代谢的主要场所，脂质摄入过多也会导致肝脏细胞的脂质沉积，并逐渐发展为非酒精性脂肪肝，影响肝脏功能[11]。冷亮等[12]通过对非酒精性脂肪肝病理模型的研究发现，SIF作用于固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)，通过抑制脂肪酸合成酶活性调节脂肪酸及胆固醇代谢，同时提高过氧化物酶体增殖物激活受体α的蛋白表达，促进脂肪酸氧化，减少肝脏脂质沉积。研究证实，非酒精性脂肪肝有演变为肝癌的可能，进一步说明SIF能够通过延缓非酒精性脂肪肝的进展降低肝癌的发生风险[13]。同时，SIF也能发挥抗炎及抗氧化作用，从而保护肝细胞，减轻酒精性肝损害[14]。肝纤维化的产生是脂肪肝向肝癌演变过程中最重要的环节，因此延缓肝纤维化进展也是防治肝癌的重要措施之一。有研究发现，SIF可以干预转化生长因子-β/Smad信号通路，抑制肝星状细胞的激活，减少平滑肌肌动蛋白的表达及胶原基质的堆积，减缓肝脏纤维化进展，减轻肝脏慢性损伤[15]。总之，SIF不仅可以通过抗氧化作用减少急性肝损害，还可以通过调节脂代谢及抗纤维化等作用缓解肝脏慢性炎症，保护肝细胞免受致癌危险因素的侵害。

2 预防肝细胞癌变的作用

从肝细胞受损到癌变发生是一个慢性累积的过程，若期间能够加以干预便能减缓甚至逆转这一过程，其中膳食结构是重要的影响因素之一。有调查显示，长期食用大豆制品的东南亚人群癌症发病率显著低于西方人群[16]，这与大豆中SIF的抗肿瘤作用密切相关[17]。除与激素相关的乳腺癌和前列腺癌外，SIF对已知的消化系统恶性肿瘤也有很好的预防作用。因此，SIF在保护肝细胞功能的同时，能否干预并阻止已处于癌变初期肝细胞的进一步发展也值得关注。肝细胞从诱癌起始期到促癌期的变化是一个复杂的多阶段过程，此过程中的及时干预有助于逆转癌变[18]。在癌变初期，肝细胞的氧化应激作用与线粒体损伤所致的氧自由基清除和产生比例失衡是导致肝细胞恶变及进展的主要原因之一[16]。而SIF可通过自身抗氧化及增强抗氧化酶活性作用干预肝脏癌变初期的氧化应激，减轻脂质过氧化反应，逆转肝细胞恶变[6]。许惠仙等[19]通过改良Solt-Faber法建立化学诱导肝癌癌前病变模型发现，SIF可降低肝脏γ-谷酰胺转肽酶及丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性，同时使丙二醛水平显著下降，可见SIF预防肝细胞癌变的作用机制与其抗氧化应激和清除氧自由基有关。不论是体外实验还是动物实验均证明，SIF的干预可逆转各种危险因素诱导正常肝细胞发生恶变并最终演变为不可逆肝癌的过程，预示着SIF的作用位点可能是阻断肝细胞癌变的理想靶点。

3 抑制肝癌细胞生长的作用

肝细胞癌变进入不可逆阶段后，失控性肝细胞分裂增殖的速度远远大于其凋亡的速度，打破了肝细胞的增殖与凋亡平衡，这也是肝癌细胞不断扩大且极具侵袭性的主要原因[20]。SIF对正常肝细胞具有保护作用，但对于肝癌细胞的作用则相反。徐春华[21]运用噻唑蓝比色法检测发现，SIF培养基中的大鼠肝癌细胞CBRH-7919的生长速度明显减慢；另有研究显示，SIF对人肝癌细胞HepG2及Bel-7402系生长有明显的抑制作用，表明SIF可以通过抑制肝癌细胞生长发挥抗肿瘤作用[22]。此外，随着SIF剂量的增加和作用时间的延长，其对肿瘤生长的抑制作用有增强趋势，表明SIF的抗肿瘤作用呈剂量及时间双重依赖性[21-23]。

对于非激素依赖性肿瘤(如肝癌)，SIF主要通过非激素参与的方式达到抗肿瘤的目的。一方面，SIF可以通过下调缺氧诱导因子-1α蛋白的表达，抑制其下游血管内皮生长因子的产生，两者的负反馈调节作用使血管内皮生长因子受体2表达减少，从而达到降低肝癌组织内的微血管密度、抑制肿瘤血管生成的目的[24]。另一方面，有研究表明SIF中的木黄酮可以通过抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)磷酸化调控EGFR/胞外信号调节蛋白激酶信号转导通路，进而限制肝癌肿瘤的生长[25]。EGFR广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面，它是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，与肿瘤疾病的进展、恶化密切相关。SIF发挥酪氨酸激酶拮抗剂的特性，通过抑制EGFR磷酸化，使肝癌肿瘤细胞生长速度明显减缓甚至停滞[25-26]。可见，SIF主要通过抑制各类肿瘤生长因子的活性，阻碍肿瘤新生血管形成、减缓肿瘤生长速度来发挥非雌激素依赖性的抗肿瘤作用。

肝癌为非激素依赖性肿瘤，但SIF同样可以通过发挥雌激素类似物作用抑制肿瘤的生长。有研究发现，SIF可通过抑制DNA甲基转移酶重新激活抑癌基因雌激素受体α基因的表达，使肝癌细胞增殖停滞于G0/G1期及G2/M期，从而抑制肝癌细胞的生长[27-28]。此外，SIF还可抑制磷酸肌醇信号通路，降低肝癌细胞内三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)水平，上调与肝癌细胞凋亡相关的Bcl-相关X蛋白基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肝癌生长[29]。由此可知，SIF可分别通过雌激素类似物作用及非激素参与两种方式调节多种信号途径，抑制肝癌细胞生长，并调控肝癌细胞的增殖与凋亡失衡，从而发挥抗肿瘤作用。

4 诱导肝癌细胞凋亡的作用

SIF的抗肿瘤作用不仅局限于抑制肿瘤生长、减缓肿瘤增殖速度，还可通过激活肿瘤细胞的凋亡信号促进恶性细胞凋亡。与SIF抑制肿瘤细胞生长的多途径作用方式相似，SIF诱导肝癌细胞凋亡的作用机制亦十分复杂，首先SIF不仅可以抑制磷酸肌醇信号转导通路，降低细胞内Ca2+水平[30]，还可同步下调肝癌细胞中硫氧还原蛋白的表达，造成肿瘤细胞内活性氧类堆积[31]；两者共同激活胱天蛋白酶(caspase)3的表达，产生促使细胞程序性死亡的级联反应。使肝癌细胞骨架降解及DNA断裂，最终达到消亡肝癌细胞的目的[32]。通过建立肝癌疾病模型发现，饮食中的SIF可以使AMP活化蛋白激酶磷酸化，同时抑制核因子κB，激活AMP活化蛋白激酶介导的凋亡途径，诱导肝癌细胞凋亡[33]。

细胞凋亡途径主要包括线粒体损伤、内质网应激及死亡受体3种[34]。研究发现，SIF可以同时通过以上3种途径诱导肝癌细胞的凋亡作用。首先，SIF可通过激活内质网应激相关调节器(caspase-12等)触发内质网途径的凋亡程序，诱导肝癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[35]。其次，线粒体损伤途径又分为依赖caspase和非依赖caspase的线粒体凋亡程序两种，SIF作用于肝癌细胞后，可以上调其p53基因表达，降低信号转导及转录激活因子3的活化，使细胞凋亡诱导因子从线粒体释放入胞质，引发非依赖caspase的线粒体凋亡程序，同时促使细胞色素C的增加，激活caspase，启动依赖caspase的线粒体凋亡途径[34]。此外，SIF可以下调缺氧诱导因子-1α，抑制肝癌细胞葡萄糖转运体及有氧糖酵解，降低肝癌细胞对生长环境的适应性；同时上调FAS蛋白表达，激活死亡受体途径，诱导肿瘤细胞凋亡[36]。综上所述，SIF的作用机制复杂，主要通过上述3种途径诱导肝癌细胞的程序性死亡。

然而，SIF不仅能单独作为药物进行抗肝癌肿瘤的治疗，还可以通过协同效应增强其他化疗药物诱导肝癌细胞凋亡及抗肿瘤的作用。有研究表明，SIF可与5-氟尿嘧啶联合使用，两者均可诱导肝癌细胞凋亡，SIF还能增强5-氟尿嘧啶的疗效[37]。不仅如此，金伟和马力[38]研究发现，SIF与顺铂联合化疗时，SIF可通过抑制核因子κB活性增强肝癌细胞对铂类药物的敏感性，减少化疗过程中肿瘤耐药性的产生。与顺铂及5-氟尿嘧啶等化疗药物相比，SIF具有更高的安全性及更低的毒副作用，是一种很有前景的辅助抗肝癌药物。

5 防治肝癌的复发及转移的作用

早期肝癌的治疗手段通常较多，包括手术切除、肝移植、微波消融及介入治疗等。但由于肝癌具有高复发率及高转移率的特点，多数患者在一线治疗后面临短期内肝癌复发及远处转移的风险，而肝癌对于传统的化疗及放疗均不敏感，因此运用理想的辅助治疗药物降低肝癌术后复发与转移的风险，同时弥补肝癌术后多学科治疗的不足是关键。肿瘤的侵袭与远处转移能力与细胞外基质的降解和破坏有关，陈鹏等[39]建立了肝癌切除后高复发与转移的裸鼠疾病模型，使用SIF进行腹腔内注射后发现，SIF对肝内复发的抑瘤率达47.2%，且脏器转移数也显著减少，其中能降解肝癌细胞外基质，引发肿瘤转移与侵袭的关键性酶为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2。而SIF能降低MMP-2蛋白及相关信使RNA的表达水平，有效减少肿瘤介导的细胞外基质降解作用，阻止肝癌的远处转移及肝内播散。在与肝癌转移和侵袭能力密切相关的MMP家族中，除MMP-2外，SIF中的木黄酮亦可通过调控包括胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶在内的多条信号通路上关键酶的磷酸化来抑制活化蛋白-1 及核因子κB的激活，阻断MMP-9的转录，减少人肝癌细胞MMP-9的分泌及产生。控制肝癌细胞的侵袭性，降低其转移潜能[40]。总之，SIF可以通过抑制肝癌细胞外受体的磷酸化来减少MMP相关酶类产生、阻止细胞外基质降解，从而降低肿瘤的转移与侵袭能力，达到预防肝癌复发与播散的目的。

6 与其他药物的联合应用

在与临床化疗药物的协同作用方面，SIF可以增加顺铂、多西紫杉醇及雷帕霉素等的抗肿瘤效应[41]。使用顺铂类药物治疗后，肝癌细胞的MMP-2表达量上升，且MMP-2与肿瘤的耐药性有关，增加了肿瘤产生耐药及潜在转移的风险；而将SIF与顺铂联合作用后，肝癌细胞的MMP-2表达量显著下降[41]。但SIF与肝癌靶向治疗药物索拉菲尼的联合应用仍存在争议，有学者认为，过量摄入SIF会引发索拉菲尼耐药，降低索拉菲尼抗肿瘤的疗效[42]。体外实验表明,SIF可以通过抑制有氧糖酵解途径提高耐药性肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性[36]。研究显示，使用索拉菲尼与SIF联合治疗小鼠肝癌移植瘤模型的肿瘤直径显著小于索拉菲尼或SIF单药治疗[36]。目前，用于肝癌辅助治疗的药物疗效均不理想，最有效的靶向治疗药物索拉菲尼也存在长期使用后的肿瘤耐药性问题。SIF与各种肝癌治疗药物联合运用在发挥协同作用增强疗效的同时，也改善了肝癌化疗药物及靶向治疗药物长期使用后产生耐药性的问题，说明SIF的出现可能为临床寻找新的肝癌治疗药物提供了新方向，但仍需对SIF的抗肿瘤作用进行更深入的研究及临床评估。

7 小 结

SIF具有潜在的医学研究价值，并在肝癌治疗方面有很好的体现，SIF不仅能够通过多种途径发挥抗肿瘤作用，还能协同其他化疗及靶向治疗药物共同作用以增强疗效。早在1996年，美国国家癌症中心就已将SIF正式纳入肿瘤化学预防药物的临床发展计划中[43]，SIF在肝癌防治方面具有一定作用，但SIF的具体作用机制尚不完全明确，相关研究尚局限于动物与细胞水平，缺乏临床药物试验证据。由于人体内SIF的作用过程复杂，其安全剂量及药物浓度范围尚无法精准把握，故有必要对SIF的抗肿瘤作用及药用价值进行深入的研究，以便对不同浓度及剂量SIF对肝癌防治作用的影响及可能产生的毒副作用进行全面评估及考察。