CAR-T的发展历程及实体瘤治疗难点

马金燕，杨勇，王昀

(中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198)

肿瘤免疫疗法是继手术、放疗、化疗之后的第四大肿瘤治疗手段，相较于其他形式的肿瘤免疫疗法，过继性细胞疗法(adoptive cell therapy，ACT)具有更多的优势及更好的疗效[1]，在这之中，嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)疗法的发展最为迅猛。CAR-T是利用人体自身免疫细胞来发挥疗效的一种治疗手段，该疗法需从患者外周血中分离出T细胞，通过基因工程手段进行修饰，使其能够表达相应靶点的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，并在体外进行扩增培养，再重新输回患者体内杀伤肿瘤细胞，并激活人体免疫系统的记忆达到持久的作用[2]。

1 CAR-T的发展历程

CAR-T的概念于1989年由Zelig Eshhar首次提出，他将抗体的轻重链与T细胞受体(T cell receptor，TCR)的恒定区相连，构建出不依赖于主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)的嵌合T细胞受体基因片段，并验证其表达和功能[3]。基于以上结果，他提出将具有肿瘤特异性的合成T细胞受体用于治疗肿瘤的可行性。随后，他又利用单链抗体(single chain fragment of variable region，scFv)替换抗体的轻重链形成新的受体，这也预示着第一代CAR-T的诞生[4]。

CAR的结构主要由3部分组成，包括胞外区、跨膜区和胞内信号域[5]。胞外区[6]包括抗原结合区域和连接用的铰链区，抗原结合区域主要来源于抗体的scFv，scFv由一个完整抗体纯化而来，通过一条肽链将抗体可变区的重链和轻链连接在一起。相较于TCR识别肿瘤抗原的复杂性，scFv识别抗原不依赖于MHC，但同时保留了特异性。除了scFv之外，其他的多肽配体或蛋白经过修饰后也能作为CAR的胞外区，例如修饰白细胞介素-13(IL-13)分子制备胞外域得到治疗胶质母细胞瘤的IL-13Rα2特异性的CAR-T，并在人体上进行了测试[7]。跨膜区处在胞外区和胞内信号域之间，一般来源于T细胞分子的现有序列。胞内域对于激发免疫反应至关重要，通常包括共刺激信号域和活化区域，共刺激信号域[8]主要用于提供共刺激信号来增强T细胞的能力，如CD28和4-1BB(CD137)。而T细胞的活化依赖于免疫受体酪氨酸活化基序(immuno-receptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)，一般选用TCRζ(CD3ζ)[9]，也有效果略差的FcRγ[10]。目前，根据不同的胞内结构域，可将CAR-T分为四代。

1.1 第一代CAR-T 第一代CAR-T的胞内区仅包含CD3ζ或FcRγ，为T细胞的活化提供刺激信号[4]。这类CAR-T虽然可以靶向肿瘤细胞，但在临床试验中发现其增殖能力较弱，治疗效果一般或无效[11]。在一项卵巢癌临床试验中发现，叶酸受体特异性的重定向T细胞未减轻肿瘤负荷，实时监测到T细胞在绝大部分患者中存在了将近3周，但未到达肿瘤部位[12]。Park等[13]利用靶向CD171(L1-cell adhesion molecule)的CAR-T治疗了6位母细胞瘤患者，输注后未发现明显毒性，其中5位患者体内的CAR-T仅维持了不到7 d，而另1位荷瘤较轻的患者得到缓解，CAR-T维持了6周左右。随着一代CAR-T临床数据的增多，研究者们意识到需要改进CAR的设计来提高抗肿瘤疗效。

1.2 第二代CAR-T 第一代CAR-T在体内增殖困难，疗效甚微，为解决这一问题，第二代CAR-T额外增加了一个共刺激信号，目前研究较多的包括CD28、4-1BB(CD137)、CD27和ICOS(inducible costimulatory molecule)。研究者[14]比较了有无共刺激信号的临床效果差异，他们设计了两种靶向CD19的CAR-T，一种仅编码TCR的CD3ζ链，另一种包含CD3ζ链和CD28的胞内域，用于治疗非霍奇金淋巴瘤患者，实验结果表明，含有CD28胞内结构域的CAR-T具有更强的扩增和持久性。Lami等[15]构建了含有4-1BB信号转导域的靶向CD19的CAR-T来治疗B细胞系急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，以患者来源的白血病细胞为靶细胞，在效靶比仅为0.01的情况下，该T细胞在五天内清除了大部分ALL细胞。与缺乏4-1BB的CAR-T相比，这些细胞扩增速率和白细胞介素-2(interleukin 2，IL-2)产生速率均更高，表明二代CAR-T具有更高的临床价值。

1.3 第三代CAR-T 第三代CAR-T在第二代的基础上进行改造，胞内域包含一个活化区和两个共刺激信号域。一项先导临床试验研究了一个同时具有CD28和4-1BB共刺激结构域的CD20特异性CAR-T对淋巴瘤的作用，三例患者在接受T细胞输注后得到了不同程度的缓解，并在肿瘤部位检测到修饰的T细胞，而外周血中低水平存在长达1年[16]。Pule等构建并比较了分别具有CD28、OX40和同时包含两个共刺激信号结构域的靶向神经节苷脂(ganglioside，GD2)的CAR-T，结果显示具有双重共刺激信号的第三代CAR T增殖时间更长、T细胞活化信号更强，分泌细胞因子IL-2的能力也得以增强[17]。但同时也有数据[18]指出与三代CAR-T相比，二代CAR-T具有更强的信号转导能力，二代和三代CAR-T孰优孰劣仍有待实验证明。

1.4 第四代CAR-T 第四代CAR-T在第二代或第三代的基础上，于胞内区进一步加入自杀基因或促炎细胞因子，以此增强对T细胞反应调控或通过释放不同的细胞因子来招募其他的免疫细胞至肿瘤部位，产生不依赖于T细胞的杀伤作用[19]。白细胞介素-12(interleukin 12，IL-12)促进干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)的释放，NK细胞和T细胞的增殖，抑制肿瘤诱导的调节性T细胞的产生并提高肿瘤的清除效率[20]。Gray等[21]构建了具有和不具有IL-12分泌的靶向CD19的CAR-T，并在小鼠淋巴瘤模型中测试两者的区别。Gray发现表达IL-12的CAR-T能够根除已建立形成的B细胞淋巴瘤，并显著改善小鼠生存率。该疗法不仅依赖于CAR-T的直接杀伤作用，还通过募集宿主免疫细胞来产生免疫应答杀伤肿瘤。

2 实体瘤相关靶点

目前，第二代CAR-T仍处于研究的主流地位，对于血液瘤而言具有较好的疗效，2017年就有两款CAR-T疗法获批上市，用于治疗急性淋巴细胞白血病的Kymriah和治疗非霍奇金淋巴瘤的Yescarta。基于血液瘤治疗的成功，第三、四代CAR-T应运而生，扩增和杀伤能力都得到了明显的改善，因此研究者们将其应用于实体瘤的治疗中，并研究不同肿瘤抗原作为靶点时CAR-T的治疗效果。

2.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3) GPC3是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的一员，借由糖基磷脂酰肌醇附着在细胞表面[22]，并在细胞生长、分化和迁移过程中发挥重要的作用。多项研究表明，GPC3可以作为肝癌的特异性靶点，在人肝细胞癌中高表达但在正常组织中表达有限，同时GPC3的高表达与肝细胞癌患者的预后呈一定的正相关[23]。Gao等[24]首次构建了以GPC3为靶点的第三代CAR-T，并检测其在肝细胞癌中的疗效，体内外试验结果均证明靶向GPC3的CAR-T可以有效清除GPC3阳性的肝癌细胞，且杀伤效果与靶细胞中GPC3表达水平呈正相关。该研究也为肝细胞癌的免疫治疗提供了新的解决思路。

2.2 人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2) HER2是受体酪氨酸激酶中表皮生长因子受体家族的一员，是胚胎发育和成人组织细胞分化增殖的必需介质之一[25]。大量研究表明HER2的过度扩增和高表达与包括胃癌、胰腺癌和乳腺癌等在内的多种肿瘤的不良预后有关。有研究者[26]进行了针对晚期胆管癌和胰腺癌的HER2靶向的CAR-T治疗，在该Ⅰ期临床试验中，所有患者均出现一定的临床应答，其中1例获得了4.5个月的部分缓解，5例病情稳定，中位无进展生存期达4.8个月，该研究数据在一定程度上证明了靶向HER2的CAR-T疗法的安全性和可行性。

2.3 间皮素(mesothelin，MSLN) MSLN是一种通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞质膜上的糖蛋白，在腹膜、胸膜腔和心包的正常间皮细胞上表达，同时在多种肿瘤中高表达，促进癌细胞的增殖和局部侵袭转移，可作为诊断和预后的检测物之一[27]。由于MSLN在正常组织中的分布有限而在某些肿瘤组织中高度表达，它也成为免疫治疗的研究靶点，一项Ⅰ期临床试验[28]利用MSLN特异性的CAR-T治疗6例胰腺导管腺癌患者，所有患者均未出现细胞因子释放综合征或神经毒性等，其中2例患者病情稳定，无进展生存时间分别为3.8和5.4个月，断层扫描监测到3例患者的肿瘤病灶代谢稳定，1例证实表达MSLN的患者活跃体积明显下降，说明以MSLN为靶点的CAR-T治疗胰腺导管腺癌的方法是可行的，具体的激活时间和治疗效果等仍需进一步的研究。

3 实体瘤CAR-T治疗的难点

虽然CAR-T在治疗实体瘤中取得了初步的疗效，但其药效逊于血液瘤。这主要与实体瘤的特性相关，与血液瘤相比，实体瘤治疗需要解决更多的难题。

3.1 靶点的选择 由于实体瘤的高度异质性，很难筛选到合适的表面抗原[29]。目前大部分研究仍选用肿瘤相关性抗原，这些抗原往往在正常组织中少量表达，因此脱靶毒性是肿瘤相关抗原CAR-T难以回避的问题。一位转移性结肠癌患者[30]在接受靶向HER2的CAR-T治疗后死亡，后发现是CAR-T识别到肺上皮细胞低水平的HER2而触发释放大量细胞因子导致的。此外，实体瘤的异质性表现在原发性肿瘤和继发性肿瘤以及相同肿瘤的不同部位之间，肿瘤生长过程中也会发生异变，这就使得治疗靶点难以选择。一项靶向表皮生长因子受体变异体Ⅲ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)的研究[31]发现CAR-T输注后部分患者肿瘤中靶抗原水平降低，但疗效不佳，不同时间检测发现患者肿瘤表面EGFRvIII的表达发生了广泛的突变，导致CAR-T无法识别变异的抗原。因此，找到合适的治疗靶点是实体瘤CAR-T治疗急需解决的首要问题。

3.2 实体瘤浸润 除去少数研究使用的瘤内注射方式，CAR-T的给药方式主要还是集中在静脉输注，CAR-T细胞需要从外周血中循环至肿瘤部位才能发挥杀伤作用。相较于血液瘤所处的均质环境，实体瘤所处的环境复杂多变，阻碍了CAR-T的浸润。实体瘤缺乏包括高内皮微静脉(high endothelial venules，HEVs)在内的各种成熟血管，但周围促血管生成因子的过度表达又诱导了不同于正常血管的肿瘤血管生成，集中在肿瘤边缘区域且结构不规则伴有过度的分支[32]，使得运输受阻。同时，实体瘤外部具有致密的纤维组织构成的物理屏障[33]，导致CAR-T难以穿透。因此，相较于抗肿瘤血管生成，研究者们越来越倾向于肿瘤血管正常化的理论，利用肿瘤血管正常化为CAR-T的浸润提供通道，增加CAR-T与肿瘤细胞接触的概率从而提高CAR-T的杀伤效果[34]。

3.3 肿瘤微环境 肿瘤微环境[35]是指肿瘤产生和生存的内环境，主要由肿瘤细胞、细胞外基质、周围血管、其他细胞(如免疫细胞和成纤维细胞)以及各种分泌因子等组成。越来越多的研究表明，抑制性肿瘤微环境促进了肿瘤的生长和转移，阻碍了免疫细胞的应答并抑制抗肿瘤疗法的疗效。肿瘤微环境是一种低pH、低氧、低营养、高渗透的恶劣环境[36]，极不利于T细胞的存活。此外，微环境中还包含肿瘤相关的巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、骨髓源性的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)等多种免疫抑制性细胞[37]，通过相关的细胞因子和抑制性受体来发挥抑制作用。以TAMs为例，其主要极化为替代激活型即M2型巨噬细胞[38]，经由L-精氨酸的代谢产生活性氧，高表达程序性死亡配体1(programmed cell death receptor ligand 1，PD-L1)，同时释放IL-10等细胞因子诱导趋化Treg等多个途径实现对T细胞功能的抑制。

4 结语与展望

CAR-T治疗肿瘤的研究仍充满了未知，这既是挑战也是转机，目前已出现了多种优化方案。第一，设计双靶点CAR-T来减少抗原逃逸现象，Hegde等[39]报道了一种双特异性CAR分子，将Her2和IL-13Rα2的抗原识别区串联在一起并取名为TanCAR，体内外试验均证明该双靶点CAR-T的杀伤效果强于单一靶点CAR-T。第二，提高CAR的灵活性和通用性，包括利用接头系统，在不改变CAR结构的前提下，由接头实现不同的靶向性部分。例如连有单体链霉亲和素的CAR-T与生物素化肿瘤相关性抗原特异性抗体联合使用以实现多靶点同时杀伤[40]；采用亮氨酸拉链作为接头系统开发出“分离、通用和可编程(split，universal and programmable，SUPER)”的CAR-T，简称SUPER CAR系统以提高免疫疗法的安全性及有效性[41]。同时，还有利用基因编辑技术CRISPR/Cas9技术对CAR-T细胞进行改造，或切除TCR等基因产生同种异体的通用CAR-T[42]，或敲除抑制性受体提高CAR-T的杀伤能力[43]。第三，CAR-T与其他免疫疗法联用，如对CAR-T细胞进行改造后使其同时能够分泌双特异性抗体(bispecific T-cell engager，BiTE)，利用CAR-T发挥直接杀伤作用的同时，释放抗体进一步激活自身免疫功能，减少免疫逃逸，从而发挥更强的抗肿瘤效果[44]。我们相信在不久的将来，随着免疫疗法的发展和临床数据的丰富，实体瘤的治疗难点一定会得以解决，更完善的CAR-T疗法必将出现，造福于更多的肿瘤患者。