外泌体及其miRNA在神经系统常见疾病诊断和治疗中的研究进展

李 武,牛晓晨,张 萌,程 叶,卢 英,田 甜,杜 姗,米 颜,史文珍,2*,田 晔,*

(1．西北大学生命科学学院,中国陕西西安710069;2．西北大学附属医院/西安市第三医院医学研究中心,中国陕西西安710016;3．延安大学医学院,中国陕西延安716000)

外泌体(exosome)是1983年Pan和Johnstone在体外研究绵羊网织红细胞转化为成熟红细胞的过程中首次发现的,其中携带多种信息分子[1]。随着社会老龄化问题日益严重,神经系统疾病发病率逐年上升,其中包括缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等在内的多发病、常见病已经成为危害老年人健康的主要“杀手”之一[2～4]。近年来,外泌体成为生物医学的研究热点,主要包括其在多种疾病发生和发展中的作用机制。本文着重对外泌体在上述3种神经系统常见疾病诊断和治疗中的研究进展进行了总结,希望为其在临床诊断和治疗方面提供思路。

1 外泌体的概述

外泌体主要来源于细胞内的多囊泡内体或多泡体,经过多囊泡内体外膜与细胞膜融合分泌到胞外间隙,直径为30～100 nm[5]。2005年,Caby等[6]首先在人的外周血中发现外泌体。现有研究显示,外泌体在人的唾液、尿液、乳汁、腹水以及脑脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)等多种体液中也广泛存在[7]。研究表明,外泌体能够作为在细胞间进行信息传递的载体,其中所携带的内容物主要包含mRNA、miRNA、DNA片段和蛋白质等多种生物活性物质[8～9]。外泌体可以通过精密的分选机制以及运送方式将内容物递送到特定的受体细胞,从而改变受体细胞的生理状态[10～11]。在某些疾病的发生和发展过程中,外泌体中所含的内容物如mi-RNA、蛋白质等会发生改变,提示外泌体可以作为潜在的生物标志物[12]。此外,外泌体也参与血管生成、免疫应答和炎症反应等多种生理过程,并且能充当靶向药物递送载体来发挥疾病治疗作用[13]。

2 外泌体的分离和鉴定

由于在提取外泌体的过程中会混杂其他种类的胞外囊泡,它们在直径、形态以及生化特性等方面具有很大的差异,而获得高纯度的外泌体是后续实验的前提和基础,因此有效地进行分离和鉴定对于外泌体的研究至关重要。目前,分离外泌体最常用的方法是超速离心法和试剂盒法。超速离心法与密度梯度离心法相结合可以得到纯度更高的外泌体。试剂盒法与超速离心法相比,操作简单、快速高效,但存在纯度不足的缺点。此外,外泌体的分离还有过滤、超滤、凝胶色谱和免疫磁珠法等诸多手段[14～15]。

外泌体的鉴定主要包括粒子直径、形态结构以及标记蛋白3个方面。纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)用来测定粒径是否符合外泌体的定义;电镜可以观察外泌体的经典结构;蛋白质印迹法(Western-blot,WB)可用来对外泌体膜上特异性表达的标记蛋白(CD63、CD81、TSG101 等)进行检测[16～17]。目前外泌体的分离纯化手段很难获得十分纯净且单一的外泌体样品,因此以上3种方法相结合可作为一种高质量的外泌体鉴定手段。

3 外泌体在神经系统常见疾病诊断中的作用

3.1 外泌体对IS的诊断作用

脑卒中是世界范围内致死和致残的主要原因[18～19],是一种发病机制复杂的脑血管疾病。脑卒中分为缺血性卒中和出血性卒中,其中IS占70%以上[20]。大量研究表明当发生IS时,外泌体中多种miRNA的表达水平会发生变化,因此证明外泌体miRNA与IS的诊断之间可能存在关联。Chen等[21]在72 h内采集50例急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者的血样进行分析后发现,与对照组相比,AIS患者中外泌体miR-223显著上调,并且与国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评分呈正相关。同时,预后不良患者中外泌体miR-223的表达高于预后良好的患者。这就说明外泌体miR-223的表达与AIS的严重程度相关,可以作为诊断IS的潜在生物标志物。Li等[22]发现,与对照组相比,亚急性期(subacute ischemic stroke,SIS)组血浆外泌体miR-422a和miR-125b-2-3p的表达水平显著降低,同时AIS组血浆外泌体miR-422a的水平升高。此外,SIS组血浆外泌体miR-422a和miR-125b-2-3p的表达水平显著低于AIS组。因此,血浆外泌体miR-422a和miR-125b-2-3p有望成为监测和诊断IS以及区分IS阶段的生物标志物。Zhou等[23]收集了来自AIS患者和健康人群的血液样品,通过定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析发现,与健康人群相比,卒中后24 h内的AIS患者的外泌体miR-134显著增加,并且与NIHSS评分、脑梗死体积呈显著正相关。这意味着外泌体miR-134有可能成为IS诊断和预后的潜在生物标志物。综上可见,外泌体miRNA有望成为IS诊断和预后相关的可靠的生物标志物;检测外泌体miRNA不仅能够为IS的临床诊断、病情评估提供有效的信息,还可以在早期对疾病的发生进行预测。

3.2 外泌体对AD的诊断作用

AD是一种神经退行性疾病,大多数患者在早期可能没有临床症状。以往临床上应用最广泛的是1984年由美国国立神经语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病学会所制定的标准,但是传统的标准不能对AD进行早期诊断,缺乏特异性和敏感性,并且存在对“可疑(possible)”AD的过度诊断。随着人们对AD生物学基础的不断认识,新修订的标准增加了影像学和实验室诊断。其中,实验室诊断主要依靠CSF中Aβ42、T-tau和P-T181-tau的浓度变化。最近研究发现,AD患者外周血神经元衍生的外泌体中Aβ42、T-tau和P-T181-tau的水平均高于对照组,并且与CSF中的 Aβ42、T-tau 和 P-T181-tau 具有一致性[24]。上述结果证实外泌体中的 Aβ42、T-tau和 PT181-tau也具有相同的诊断AD的能力。

此外,外泌体中的多种miRNA也可以被视为诊断AD的潜在生物标志物。Yang等[25]通过qRT-PCR对AD患者的外周血进行分析后发现,与对照组相比,AD组中外周血外泌体miR-135a和miR-384的水平均上调,而miR-193b的水平下调。之后有学者从分离于早发性AD(youngonset Alzheimer’s disease,YOAD)患者脑脊液的外泌体miRNA表达谱中发现,miR-16-5p、miR-125b-5p、miR-451a和miR-605-5p与对照组相比呈现出差异表达。在另一组迟发性AD(late-onset Alzheimer’s disease,LOAD)患者中,miR-125b-5p、miR-451a和miR-605-5p也具有类似的差异表达,但miR-16-5p与对照组相比无差异表达[26]。由此可见,外周血和脑脊液中的外泌体miRNA有望成为诊断AD的潜在生物标志物。因此,外泌体中包含的Aβ、T-tau以及miRNA在AD的发生、发展过程中扮演着重要角色,检测外泌体中Aβ、T-tau以及miRNA的表达水平对于AD临床诊断、预后评估具有重要的参考价值。

3.3 外泌体对PD的诊断作用

PD是一种常见于中老年的神经系统病变疾病,临床上以静止性震颤、运动迟缓肌强直和姿势平衡障碍为主要特征[27]。其进展缓慢且发病机制尚未完全清楚,早期临床症状不明显。随着PD研究的不断深入,临床上也将脑脊液中α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)的含量改变作为辅助诊断PD的手段之一。有研究发现,与对照组相比,α-Syn在PD患者CSF中的含量较低,而在患者血浆外泌体中的含量更高,并且血浆中外泌体α-Syn的含量与PD的严重程度存在显著相关性。该结果表明外泌体α-Syn有助于诊断PD[28]。

近年来的研究发现,CSF和外周血中的外泌体miRNA具有成为诊断PD生物标志物的潜在价值。2015年,Gui等[29]发现,与健康对照组相比,PD患者CSF外泌体中miR-1和miR-19b-3p的表达下调,而miR-153、miR-409-3p和miR-10a-5p的表达上调。相关研究也报道,外周血外泌体中 miR-185、miR-15b、miR-221、miR-181a、miR-331-5p以及miR-505的含量在PD患者中均存在显著变化[30～31]。这些表明CSF和外周血中的外泌体miRNA在PD的诊断方面具有潜在价值。如上所述,外泌体中的α-Syn和miRNA与PD的严重程度具有显著相关性,可能成为评估临床PD患者病情发展的有效生物标志物。

4 外泌体在神经系统常见疾病治疗中的作用

4.1 外泌体对IS的治疗作用

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一种可分化成多种特异性细胞的多能干细胞,在骨髓、胎盘、脐血和脂肪组织中均可得到[32]。其衍生的外泌体在治疗IS中具有应用潜力。有研究表明,从miR-133b过表达的MSC中分离出的外泌体能够改善神经元的可塑性以及卒中后的神经功能恢复,同时刺激星形胶质细胞促进神经突起外泌体的二次释放[33]。研究人员还发现,与对照MSC外泌体相比,转染miR-17-92簇的MSC衍生的外泌体通过下调PTEN水平激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,使得糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的活性受到抑制,从而显著促进神经再生[34]。

此外,其他种类细胞衍生的外泌体对卒中后脑部功能的恢复也具有积极的作用。2019年,Song等[35]在小鼠脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤模型中发现,M2小胶质细胞衍生的外泌体中的miR-124通过下调其下游靶标泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14,USP14)的表达来减少神经细胞的凋亡,并且促进神经元的存活。近期研究发现,内皮细胞衍生的外泌体部分抑制I/R诱导的SH-SY5Y神经细胞的凋亡,从而使其免受I/R损伤[36]。另有研究报道,姜黄素负载的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell)衍生的外泌体能够减轻IS造成的损伤,并有助于恢复小鼠脑I/R损伤后的神经血管功能[37]。

由于大脑具有血脑屏障,这就降低了外泌体进入脑梗塞部位的效率。Yang等[38]发现,狂犬病病毒糖蛋白(rabies viral glycoprotein,RVG)修饰的外泌体可以穿过血脑屏障,并有效地将miR-124转移到脑梗塞部位。因此,RVG-外泌体作为递送载体在IS的临床治疗中具有潜在的作用。

综上可知,外泌体可能成为IS的新治疗方案,并在临床治疗方面拥有巨大的发展潜力。

4.2 外泌体对AD的治疗作用

AD的病理机制主要是由于大脑神经中β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉积形成斑块,对神经突触造成损伤,从而使记忆力和认知能力丧失[39]。2014年,Yuyama等[40]发现神经母细胞瘤衍生的外泌体表面富含一种鞘糖脂(glycosphingolipid,GSL),其对Aβ在体外和体内的结合以及在外泌体上的组装是必不可少的;通过将携带GSL的外泌体注射到Aβ大鼠脑中,能够降低Aβ水平,从而减轻淀粉样蛋白的沉积。随后,相关研究发现,与对照组相比,脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)衍生的外泌体能够使AD小鼠来源的神经干细胞中的Aβ42水平、Aβ40水平以及Aβ42/40比值下降。该研究还进一步发现ADSC衍生的外泌体能够降低AD小鼠来源的神经干细胞的凋亡,增强大脑中被Aβ损伤的神经突触的生长,从而改善神经功能[41]。脑啡肽酶(neprilysin,NEP)是一种重要的降解Aβ沉积的酶。Katsuda等[42]发现人ADSC衍生的外泌体可分泌NEP,将携带有NEP的外泌体转移到小鼠来源的神经瘤母细胞中,能够部分降解其中的Aβ,从而降低淀粉样斑块的形成。这些研究都提示外泌体可以通过减少Aβ沉积来改善AD,有望成为AD潜在的治疗来源。总的来讲,外泌体在治疗AD方面具有一定的应用前景。

4.3 外泌体对PD的治疗作用

PD显著的病理学改变包括:中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡;纹状体多巴胺含量显著性减少;以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体,也称路易小体(Lewy bodies)[43]。有研究发现,源自人类脱落乳牙的牙髓的干细胞(stem cell derived from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth,SHED)衍生的外泌体能够抑制6-羟基多巴胺(6-hydroxy-dopamine,6-OHDA)诱导的多巴胺能神经元凋亡,从而对神经起到保护作用,这提示SHED衍生的外泌体可能具有治疗PD的潜力[44]。2018年,相关研究报道,血液外泌体能够穿过血脑屏障成功地将多巴胺递送至大脑中的纹状体和黑质,使得多巴胺在大脑中的浓度增加;在PD小鼠模型中,相比于静脉内注射多巴胺,外泌体负载的治疗效果更优,并且毒性也更低[45]。随后,Ren等[46]发现了能够特异性识别α-Syn的DNA适配体。在小鼠PD模型中,通过RVG修饰的外泌体可将适配体有效地递送到脑中,从而显著减少病理性α-Syn聚集体和神经元凋亡,并且还可以改善运动障碍。以上信息提示,外泌体有希望成为靶向治疗PD的药物递送载体。总的来讲,外泌体在PD的治疗方面具有潜在价值,有望成为新的研究热点。

5 展望

外泌体作为一种包含多种生物信息分子的囊泡,在生物体内发挥着重要的生物学功能。近年来许多研究发现,外泌体在心血管疾病(如心肌梗死)、自身免疫疾病(如类风湿性关节炎)以及肿瘤等多种疾病的发生和发展过程中扮演着重要角色[47～49],其在神经系统常见疾病的诊断和治疗方面也具有广阔空间。目前,虽然外泌体在神经系统常见疾病的诊断和治疗中已经展开广泛研究,但仍然存在一些问题:1)外泌体中RNA的研究主要集中在miRNA,有关其他的特异性RNA如长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)等的研究较少,存在一定的局限性;2)外泌体作为一种新型载体,如何将“药物”有效地加载到其中以及其在动物体内的生物安全性如何还不太明确;3)临床应用中缺乏足够多的样本数量和临床数据,外泌体在这些疾病的诊断和治疗中的研究仍处于理论与实验阶段;4)外泌体中所携带的多种生物活性物质在此类疾病中的作用机制尚未完全清楚。虽然研究过程中存在诸多局限和挑战,但是随着该研究领域的不断深入,越来越多新的研究方法和技术将被开发运用,这将大大推动外泌体的研究,从而使其在疾病的诊断和治疗中发挥更大更具价值的作用。