乳酸菌发酵柚子蜂花粉酱加工工艺的研究

刘玳瑶，程冰晓，刘然，魏月，*，马晶军，*

（1.河北农业大学理工学院，河北沧州061100；2.北京天宝康高新技术开发有限公司，北京100084）

柚子含有大量的维生素[1]、类黄酮[2]和挥发性成分[3]等活性成分[4-5]，具有清热止咳[6]、降糖降脂[7-8]、去油解腻等功效[9]。我国可用来种植柚子的地域十分广泛[10]，且产量较大。蜂花粉是蜜蜂从植物花朵上采集的花粉粒，经蜜蜂加工而形成的花粉团，素有“天然营养库”之称，富含多种活性物质[11-12]，具有较强的抗氧化活性[13-15]，同时还伴有特殊的蜂花粉香味[16]，但蜂花粉直接食用时会产生泥沙感，口感腥腻[17]，这也是目前市场上蜂花粉深加工产品较少的主要原因。因此将蜂花粉与柚子混合制成蜂花粉酱，不仅可以明显改善蜂花粉的口感，又可充分发挥柚子和蜂花粉的生理功能，从而推进了蜂花粉深加工产品的发展，提升蜂花粉经济价值。

目前市场上蜂花粉深加工产品[18-21]主要包括蜂花粉片、蜂花粉功能性饮料、蜂花粉酸奶、蜂花粉面包等，但蜂花粉酱还较少。利用乳酸菌发酵[22-23]柚子蜂花粉酱，既可以改变蜂花粉酱的风味[24]，克服其原材料带来的腥腻等口感，还可以经过乳酸菌发酵而产生新的活性物质[25]，从而在原材料的基础上，提高产品的营养价值和经济价值，同时有研究表明发酵还可以延长蜂花粉酱的保藏期限[26]。因此利用乳酸菌发酵制作柚子蜂花粉酱，充分发挥出柚子和蜂花粉的生理功能，改善柚子蜂花粉酱单一的口感。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柚子、白砂糖：市售；蜂花粉：采自于北京密云蜂场中的茶花花粉；优比特发酵菌粉：进口10 菌（包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）：青岛凯麦森食品科技有限公司；果胶、无水柠檬酸（食品级）：河南万邦实业有限公司。

牛血清白蛋白、葡萄糖（纯度≥99%）、柠檬酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、酒石酸钾钠（分析纯）、硫酸铜（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Waters1525）：德祥科技有限公司；美的搅拌机（MJ-WBL2531H）：广东美的生活电器制造有限公司；九阳电磁灶（C21-SX810）：杭州九阳生活电器有限公司；电热恒温培养箱（DH-600AB）：北京中兴伟业仪器有限公司；高速冷冻离心机（Hc-3018R）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；可见分光光度计（LIVI-300）：蓝莫德科学仪器有限公司；电子天平（感量为0.1 mg）：上海菁海仪器有限公司；涡旋仪（MX-S）：美国赛洛捷克。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 工艺步骤

1.3.2.1 柚子预处理

将色泽正常、成熟、无霉变、无其他不良变化的柚子，去除外皮和籽，取果肉；将果肉置于适量水[果肉∶水=1 ∶1（体积比）]中，电磁炉上加热至沸，烫漂 7 min～8 min，弃去热水，换水，再次烫漂，重复操作3 次～4 次，此过程为去除柚子中柚皮苷造成的苦涩味[27]。

1.3.2.2 打浆

将烫漂后的果肉取出，冷却，置于搅拌机中打浆。

1.3.2.3 混匀

柚子浆称重，根据柚子浆质量，按比例（10%、15%、20 %、25 %、30 %）添加白砂糖，搅拌至溶解；待溶解后，按比例（5%、6%、7%、8%、9%）添加蜂花粉、发酵菌粉（1%，复合菌，以乳酸菌为主），混匀。

1.3.2.4 恒温发酵

将混匀后的柚子蜂花粉浆置于密封玻璃罐内，于电热恒温培养箱内，40 ℃恒温发酵。

1.3.2.5 浓缩

发酵后，将柚子蜂花粉浆加热至80 ℃，按所需比例（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）加入果胶，小火熬至均匀，期间不断搅拌，待冷却后，按所需比例加入柠檬酸，混匀。

1.3.2.6 灌装、杀菌、冷却

密封玻璃罐预先消毒、烘干，将浓缩后的蜂花粉酱置于玻璃罐内，密封；灌装后，置于100 ℃沸水或蒸汽中，杀菌10 min～15 min；杀菌后，快速冷却至25 ℃，得到成品。

1.3.3 预试验设计

柚子经预处理、打浆后，根据密封玻璃罐的容积大小，称取柚子浆100 g～150 g，以柚子浆的质量为基准，添加15%白砂糖、8%蜂花粉、1%发酵菌粉（复合菌，以乳酸菌为主），与之混合均匀，40 ℃恒温发酵12 h，发酵后，添加0.20%果胶、0.20%柠檬酸进行浓缩调味，经灌装、杀菌、冷却后，得到成品，并进行理化指标检测和感官评定。

1.3.4 单因素试验设计

根据预试验结果，确定蜂花粉酱的最初配方，以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准，选取白砂糖用量、发酵时间、果胶用量、蜂花粉用量4 个主要因素进行四因素五水平单因素试验，对蜂花粉酱成品进行理化指标检测和感官评定，综合确定蜂花粉酱各个因素的最佳值。

1.3.5 响应面试验设计

根据单因素试验结果，使用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计，采用Box-Behnken 模型，确定白砂糖用量、发酵时间、果胶用量、蜂花粉用量4 个因素为自变量，成品感官得分为考察目标，以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准，进行29 组试验，每组试验做3 个平行，取其平均值。试验自变量因素编码及水平见表1。

表1 响应面试验因素编码及水平Table 1 Response surface test factor coding and level

1.3.6 理化指标检测

柚子蜂花粉浆经过乳酸菌发酵，发酵其中的糖使还原糖含量减少，总酸含量增加，尤其是柠檬酸含量的增加[28]。蜂花粉中含有丰富的蛋白质，经乳酸菌发酵后蛋白质含量有所增加[29-30]，所以通过检测柚子蜂花粉酱中蛋白质、还原糖、总酸和柠檬酸含量，来评定成品的发酵程度和营养价值。

蛋白质含量检测：采用双缩脲法[31-32]，对蜂花粉酱成品蛋白质含量进行测定。

还原糖含量检测：参照GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法，对蜂花粉酱成品还原糖含量进行测定。

总酸含量检测：参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法，对蜂花粉酱成品总酸含量进行测定。

柠檬酸含量检测：参照GB 5009.157-2016《食品安全国家标准食品有机酸的测定》中的高效液相色谱法[33-34]，对蜂花粉酱成品柠檬酸含量进行测定。

1.3.7 感官评定

由10 名食品专业的感官评定人员对蜂花粉酱成品按照色泽、滋味与口感、杂质和组织状态4 项感官指标进行品尝打分，结果取平均值，其感官评分标准见表2。

表2 感官评分标准Table 2 Sensory scoring criteria

续表2 感官评分标准Continue table 2 Sensory scoring criteria

1.3.8 微生物指标检测

对蜂花粉酱成品进行微生物指标检测：菌落总数按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定；大肠菌群按照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》进行测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 白砂糖用量的优化

试验以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准，在蜂花粉用量6%，发酵菌粉（复合菌，以乳酸菌为主）用量1%，40 ℃发酵12 h，果胶用量0.15 %，柠檬酸用量0.2 %的条件下，对白砂糖用量为10%、15%、20%、25%、30%进行试验，通过理化指标检测和感官评定，得到不同白砂糖用量柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果如图1、感官评价结果如图2。

图1 不同白砂糖用量柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果Fig.1 Evaluation results of physical and chemical indicators of different white sugar consumption pomelo bee pollen sauce

由图1 可知，随着白砂糖用量的增加，柚子蜂花粉酱成品的柠檬酸和总酸含量均呈上升、下降、又上升、再下降的趋势，蛋白质含量呈下降、上升、又下降的趋势，还原糖含量呈上升的趋势，但其增长趋势趋于平缓。在白砂糖含量10%和25%时，成品蛋白质含量较高，但在白砂糖用量25%时，成品柠檬酸和总酸含量最高。这是因为乳酸菌发酵糖而产生柠檬酸等有机酸，且发酵程度随糖含量增加逐渐增大；又因为蜂花粉中含有丰富的蛋白质且发酵后含量有所增加，所以在成品蛋白质、总酸、柠檬酸含量较高，还原糖含量较低时，成品的发酵程度越好。因此，在白砂糖用量25%时，柚子蜂花粉酱发酵效果最好。

图2 不同白砂糖用量柚子蜂花粉酱的感官评价结果Fig.2 Sensory evaluation results of different white sugar consumption pomelo bee pollen sauce

由图2 可知，随着白砂糖用量的增加，柚子蜂花粉酱成品的感官得分呈先上升后下降的趋势。在白砂糖用量20%和25%时，成品感官得分较高。在白砂糖用量10%～20%时，糖含量低，柚子原有的涩味未能得到充分调和；白砂糖用量在25%以上时，糖含量高，口感偏甜。

综合理化指标和感官得分结果，柚子蜂花粉酱成品在白砂糖用量25%时，发酵程度最好且感官得分最高，酸甜适中。

2.1.2 发酵时间的优化

试验以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准，在白砂糖用量25%，蜂花粉用量7%，发酵菌粉（复合菌，以乳酸菌为主）用量1%，果胶用量0.15%，柠檬酸用量 0.2%的条件下，分别 40 ℃恒温发酵 8、12、16、20、24 h，通过理化指标检测和感官评定，得到不同发酵时间柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果如图3、感官评价结果如图4。

图3 不同发酵时间柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果Fig.3 Evaluation results of physical and chemical indicators of pomelo bee pollen sauce at different fermentation times

由图3 可知，随着发酵时间的增加，柚子蜂花粉酱成品的还原糖和总酸含量呈先下降后上升的趋势，蛋白质含量呈下降、上升、下降、上升的趋势但变化趋势不明显，柠檬酸含量呈先下降后上升至平缓的趋势。在发酵8 h～12 h 内，成品总酸含量较低，容易受到杂菌污染。在发酵20 h～24 h 时，成品柠檬酸和总酸含量较高，还原糖含量高，这期间由于发酵时间的延长，可能产生除柠檬酸之外的其他酸性物质。在发酵12 h～16 h时，成品还原糖含量较低，但在发酵16 h 时，成品柠檬酸和蛋白质含量较高，成品发酵程度较好。

图4 不同发酵时间柚子蜂花粉酱的感官评价结果Fig.4 Sensory evaluation results of pomelo bee pollen sauce at different fermentation times

由图4 可知，随着发酵时间的增加，柚子蜂花粉酱成品的感官得分呈上升、下降后上升的趋势。在发酵16 h 时，成品感官得分最高。在发酵24 h 时，其感官得分较高，但成品香味不纯正，口感欠佳。在发酵8 h～12 h 内，其感官得分较低，此时成品香味不浓郁，口感较差。

综合理化指标和感官得分结果，柚子蜂花粉酱成品在发酵16 h 时，发酵程度好且感官得分最高，香味纯正。

2.1.3 果胶用量的优化

试验以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准，在白砂糖用量25%，蜂花粉用量7%，发酵菌粉（复合菌，以乳酸菌为主）用量1%，40 ℃恒温发酵16 h，柠檬酸用量0.2%的条件下，分别使果胶用量为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%进行试验，通过理化指标检测和感官评定，得到不同果胶用量柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果如图5、感官评价结果如图6。

图5 不同果胶用量柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果Fig.5 Evaluation results of physical and chemical indicators of different pectin dosage pomelo bee pollen sauce

由图5 可知，随着果胶用量的增加，柚子蜂花粉酱成品的柠檬酸和总酸含量呈先上升后下降的趋势，蛋白质含量呈下降、上升、下降、上升的趋势，还原糖含量呈上升、下降再上升的趋势，但变化趋势均不明显。这说明果胶用量对蜂花粉酱的发酵影响不大。在果胶用量0.15%～0.25%时，成品蛋白质、还原糖、柠檬酸和总酸含量均较高，在果胶用量0.20%时，成品柠檬酸和总酸含量最高，柚子蜂花粉酱成品发酵较为充分，营养价值高。

图6 不同果胶用量柚子蜂花粉酱的感官评价结果Fig.6 Sensory evaluation results of different pectin dosage pomelo bee pollen sauce

由图6 可知，随着果胶用量的增加，柚子蜂花粉酱成品的感官得分呈先上升后下降再上升的趋势。在果胶用量0.15%时，成品感官得分最高。在果胶用量0.05%～0.10%范围内，成品粘稠度较差，有少许析水，口感欠佳。在果胶用量0.20%～0.25%范围内，成品粘稠度过大，口感粗糙，易成块状。

综合理化指标和感官得分结果，柚子蜂花粉酱成品在果胶用量0.15%时，发酵程度好且感官得分最高，组织状态佳。

2.1.4 蜂花粉用量的优化

试验以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准，在白砂糖用量25%，发酵菌粉（复合菌，以乳酸菌为主）用量1%，40 ℃恒温发酵16 h，果胶用量0.15%，柠檬酸用量0.2%的条件下，分别使蜂花粉用量为5%、6%、7%、8%、9%进行试验，通过理化指标检测和感官评定，得到不同蜂花粉用量柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果如图7、感官评价结果如图8。

图7 不同蜂花粉用量柚子蜂花粉酱的理化指标评价结果Fig.7 Evaluation results of physical and chemical indicators of different bee pollen dosage pomelo bee pollen sauce

由图7 可知，随着蜂花粉用量的增加，柚子蜂花粉酱成品的蛋白质、柠檬酸和总酸含量均呈上升趋势，还原糖含量呈下降趋势。这说明随着蜂花粉用量增加，成品发酵程度越好，营养价值越高。在蜂花粉用量7%～9%时，成品蛋白质、还原糖、柠檬酸和总酸含量变化趋势不明显，在此阶段柚子蜂花粉酱发酵程度较好，营养价值较高。

图8 不同蜂花粉用量柚子蜂花粉酱的感官评价结果Fig.8 Sensory evaluation results of different bee pollen dosage pomelo bee pollen sauce

由图8 可知，随着蜂花粉用量的增加，柚子蜂花粉酱成品的感官得分呈先上升后下降再上升的趋势。在蜂花粉用量7%时，成品感官得分最高，具有独特的蜂花粉香味，口感丰富。在蜂花粉用量5%～6%时，成品蜂花粉香味较小；在蜂花粉用量8%～9%时，口感较为粗糙。

综合理化指标和感官得分结果，柚子蜂花粉酱成品在花粉用量7%时，发酵程度好且感官得分最高，口感最佳。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，使用Design-Expert 8.0.6软件，采用Box-Behnken 模型，进行响应面试验设计，试验结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and results

2.2.2 方差分析

根据试验结果，使用Design-Expert 8.0.6 软件进行多元回归拟合分析，得到回归方程Y=91.37+0.35A+0.53B-0.45C+0.051D+2.31AB+1.38AC+1.36AD-1.42BC+0.063BD-0.55CD-1.92A2-1.92B2-2.17C2-1.61D2。

为检验方程的有效性，对柚子蜂花粉酱感官得分的数学模型进行方差分析，结果见表4。

由表4 可知，该回归模型决定系数（R2）为0.958 6，校正系数（Adj R2）为0.9172，预测系数（Pred R2）为0.832 5，说明该模型预测性良好，与实际值拟合较好，模型选择正确。该模型P 值＜0.000 1，说明该模型极显著；失拟项P 值为0.779 8＞0.05，说明失拟项不显著，表明该回归方程拟合度高，试验误差小，可反映出柚子蜂花粉酱的感官得分与各因素之间的关系。且该回归模型一次项 B（发酵时间）、二次项 A2、B2、C2、D2、交互项 AB、AC、AD、BC 均达到极显著水平，一次项 C（果胶用量）达到显著水平。由F 值可知，各因素对柚子蜂花粉酱感官得分的影响依次为发酵时间＞果胶用量＞白砂糖用量＞蜂花粉用量。发酵时间的长短直接影响蜂花粉酱的发酵程度，发酵时间短，发酵不充分，易受到杂菌污染；发酵时间过长，易导致腐败菌生长。其次，果胶用量可以影响蜂花粉酱的粘稠度，果胶用量过少，导致成品粘稠度低，口感较差；果胶用量过多，导致成品形态、口感较差，且不符合GB/T 22474-2008《果酱》标准。

表4 回归模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance

2.2.3 响应面的交互效应分析

使用Design-Expert 8.0.6 软件对柚子蜂花粉酱进行分析，得到各因素交互效应对成品感官得分的影响见图9～图 12。

图9 白砂糖用量和发酵时间对成品感官得分影响的响应曲面及等高线Fig.9 Response surface and contour of the influence of white sugar dosage and fermentation time on the sensory score of finished products

图10 白砂糖用量和果胶用量对成品感官得分影响的响应曲面及等高线Fig.10 Response surface and contour of the influence of white sugar dosage and pectin dosage on the sensory score of the finished product

图11 白砂糖用量和蜂花粉用量对成品感官得分影响的响应曲面及等高线Fig.11 Response surface and contour of the influence of white sugar dosage and bee pollen dosage on the sensory score of the finished product

由图9 可知，白砂糖用量与发酵时间的交互效应对成品感官得分影响的响应曲面坡度陡峭，且等高线呈椭圆形，交互效应显著，分别固定白砂糖用量和发酵时间，感官得分随发酵时间和白砂糖用量均先增大后减小，分别在16 h 和25%达到最大值。发酵时间长短影响成品的酸度，白砂糖用量会中和酸度，从而使口感达到最佳。因此，在白砂糖用量25%、发酵16 h时，两者交互作用效果最好，柚子蜂花粉酱发酵程度最好，口感佳，营养价值较高。

由图10 可知，白砂糖用量与果胶用量的交互效应对成品感官得分影响的响应曲面坡度陡峭，且等高线呈椭圆形，交互效应显著，分别固定白砂糖用量和果胶用量，感官得分随果胶用量和白砂糖用量均先增大后减小，分别在0.15%和25%达到最大值。白砂糖用量影响成品的发酵程度和口感，白砂糖含量过高，导致发酵程度低；白砂糖含量过少，口感差。同时果胶用量影响成品的组织形态和口感。因此，在白砂糖用量25%、果胶用量0.15%时，两者交互作用效果最好，柚子蜂花粉酱感官得分最高。

图12 发酵时间和果胶用量对成品感官得分影响的响应曲面及等高线Fig.12 Response surface and contour of the influence of fermentation time and pectin dosage on the sensory score of the finished product

由图11 可知，白砂糖用量与蜂花粉用量的交互效应对成品感官得分影响的响应曲面坡度陡峭，且等高线呈椭圆形，交互效应显著，分别固定白砂糖用量和蜂花粉用量，感官得分随蜂花粉用量和白砂糖用量均先增大后减小，分别在7%和25%达到最大值。蜂花粉用量影响成品的口感，蜂花粉用量过多，成品口感较为粗糙；蜂花粉用量过少，香味较淡，且营养价值偏低。而白砂糖会减弱蜂花粉对成品造成的腥腻感，因此，在白砂糖用量25%、蜂花粉用量7%时，两者交互作用效果最好，柚子蜂花粉酱口感最佳。

由图12 可知，发酵时间与果胶用量的交互效应对成品感官得分影响的响应曲面坡度陡峭，且等高线呈椭圆形，交互效应显著，分别固定发酵时间和果胶用量，感官得分随果胶用量和发酵时间均先增大后减小，分别在0.15%和16 h 达到最大值。发酵时间和果胶用量均影响成品的组织形态。因此，在发酵16 h、果胶用量0.15%时，柚子蜂花粉酱组织形态达到最好，感官得分最高。

通过Design-Expert 8.0.6 软件分析，得到乳酸菌发酵柚子蜂花粉酱，在以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准时，最佳工艺配方为：白砂糖用量26.78%，发酵时间17.64 h，果胶用量0.14%，蜂花粉用量7.20%，在此条件下柚子蜂花粉酱感官得分理论值为91.583 6分。实际操作条件为白砂糖用量25%、发酵时间16 h、果胶用量0.15%、蜂花粉用量7%，在此条件下柚子蜂花粉酱感官得分为91.37 分。实际值与预测值之间差异不显著，说明回归模型拟合度好，对柚子蜂花粉酱的工艺优化是可行的。

2.3 柚子蜂花粉酱质量评价结果

根据响应面试验结果，对柚子蜂花粉酱最佳工艺进行理化指标检测，结果如下：蛋白质含量0.107%，还原糖含量24.784%，柠檬酸含量0.329%，总酸含量0.947%。产品微生物指标均符合GB/T 22474-2008《果酱》标准。

3 结论

本试验以柚子、蜂花粉为主要原料，经乳酸菌发酵制成柚子蜂花粉酱。通过单因素试验，结合蜂花粉酱成品的理化指标和感官评定结果进行综合评价，最终确定各因素最佳用量，在此基础上，对柚子蜂花粉酱的制作工艺进行响应面设计，得到在以柚子浆的质量（100 g～150 g）为基准时，最佳工艺配方为：白砂糖用量25%、发酵时间16 h、果胶用量0.15%、蜂花粉用量7%，在此条件下制得的蜂花粉酱色泽均匀，颜色金黄，酸甜可口，粘稠度良好，营养价值高，具有独特的蜂花粉香味。经乳酸菌发酵的柚子蜂花粉酱能充分发挥出柚子和蜂花粉的生理功能，改善普通果酱单一的口感，增加其厚重感。将柚子、蜂花粉深加工制作成酱，改善其本身的口感，拓宽柚子、蜂花粉的加工市场，增加其商业价值。