植物源化合物肉桂醛对单核细胞增生李斯特氏菌的抑制作用

王帆 刘小莉

摘要：研究了植物源化合物肉桂醛对单核细胞增生李斯特氏菌（Lm）的抑制作用。肉桂醛对Lm的最小抑制浓度和最小杀菌浓度分别为150、300 μg/mL。经过肉桂醛处理的Lm细胞出现菌体细胞变形、膨大的现象，胞外的葡萄糖和核酸含量明显高于对照，胞内蛋白含量降低，说明肉桂醛处理使得Lm细胞通透性增大，并且抑制了Lm的蛋白合成。流式细胞仪分析结果显示，最小杀菌浓度的肉桂醛处理6 h后，细胞死亡率可达到95.6%。

关键词：肉桂醛;单核细胞增生李斯特氏菌;抑制作用

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）24-0194-04

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一种人畜共患的食源性致病菌，主要存在于水产品、乳品、肉品等动物性食品中，对特定人群（孕妇、新生儿、老人以及免疫缺陷者）的潜在威胁很大，致死率高达20%～30%[1-2]。与大多数病原菌不同的是，Lm在低温条件下仍可生长繁殖，在食品加工与贮藏过程中容易造成污染引起食物中毒，随着生活节奏的加快，人们对冷藏以及即食食品的需求比重日益加大，Lm潜在的危险性也逐渐凸显。现有的防控措施中，化学方法可以快速杀菌但也存在安全隐患，因此开发安全高效的新型抑菌剂具有巨大的应用潜力。

肉桂醛（cinnamaldehyde）在自然界主要存在于樟属植物中，工业上通常以化学合成的方法进行制备。它的应用极其广泛，在医药领域被用于抗肿瘤、抗病毒等，在食品领域被用作食用香料以及防腐保鲜剂[3]。近年研究表明，肉桂醛对Lm表现出较好的抑制效果[4-6]，但肉桂醛对Lm的作用机制却很少有报道。本研究探索肉桂醛抑制Lm的作用机制，为将肉桂醛开发成为新型高效抑菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和试剂

Lm CICC21532采购自中国工业微生物菌种保藏中心，脑心浸液（BHI）培养基采购自北京陆桥公司，肉桂醛采购自国药集团，羧基荧光素二乙酸酯（cFDA）、碘化丙啶（PI）采购自美国Sigma公司。

1.2 菌液和药液制备

将Lm接种于无菌BHI培养基中，37 ℃培养 16 h 至对数期，以BHI培养基调整菌液浓度至1×107 CFU/mL备用。以乙醇作溶剂将肉桂醛配置成浓度为1×105 μg/mL的母液。

1.3 Lm对肉桂醛的敏感性测定

在96孔板上将肉桂醛母液用BHI培养基进行梯度稀释，使其作用浓度分别为0、25、50、75、100、150、200、300 μg/mL，菌液浓度为1×107 CFU/mL，37 ℃培养24 h。采用超微量微孔板分光光度计于600 nm测定96孔板的吸光度，测定肉桂醛对Lm的最小抑制浓度（MIC）。在没有浑浊的微孔中接种50 μL培养液涂布于BHI琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，测定肉桂醛对Lm的最小杀菌浓度（MBC）。

1.4 肉桂醛对Lm细胞形态的影响

Lm培养至对数期，加入肉桂醛使其作用浓度分别为MIC和MBC，用无菌水作空白对照，37 ℃、120 r/min 处理6 h后离心收集菌体，用0.1 mol/mL pH值7.4的磷酸缓冲液洗涤3次，加入2.5%戊二醛于4 ℃过夜固定。菌体采用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水置换，每次15 min，脱水后临界点干燥，将干燥的菌体固定到金属台上，用离子溅射仪对金属台喷金、镀膜，扫描电镜观察拍照。

1.5 肉桂醛对Lm细胞通透性的影响

Lm培养至对数期，用无菌磷酸缓冲液（0.1 mol/mL，pH值7.4）洗涤重悬，加入肉桂醛使其作用浓度分别为MIC和MBC，用无菌水作空白对照，置于37 ℃、120 r/min条件下培养，分别于0、1、2、3、4、5、6 h取样，离心收集上清液，采用F006试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定葡萄糖含量，260 nm紫外吸光度反映核酸含量的变化。

1.6 肉桂醛对Lm细胞蛋白的影响

Lm培养至对数期，用无菌磷酸缓冲液（0.1 mol/mL，pH值7.4）洗涤重悬，加入肉桂醛使其作用浓度分别为MIC和MBC，用无菌水作空白对照，37 ℃、120 r/min处理6 h，经细胞破碎仪破碎后离心，取沉淀加入等体积上样缓冲液混合，于100 ℃沸水浴中保温5 min，取出冷却至室温后进行SDS-PAGE凝胶电泳（分离胶12%，浓缩胶4%，电压120V）。用染色液染色2～3 h，再用脱色液进行处理后观察拍照。

1.7 Lm细胞死亡的测定

Lm培养至对数期，用无菌磷酸缓冲液（0.1 mol/mL，pH值7.4）洗涤重悬，加入肉桂醛使其作用浓度分别为MIC和MBC，用无菌水作空白对照，37 ℃、120 r/min处理6 h。菌悬液样品加入cFDA荧光探针（终浓度50 μg/mL），37 ℃避光装载10 min，无菌磷酸缓冲液洗涤后加入PI荧光探针（终浓度30 μg/mL），室温避光装载10 min，无菌磷酸缓冲液洗涤重悬后进行流式细胞仪分析检测。流式细胞仪激发波长488 nm，检测器FL1检测波长525 nm，检测器FL3检测波长620 nm，cFDA进入FL1荧光通道，PI进入FL3荧光通道，获取FL1-FL3散点图。

1.8 数据处理与分析

所有试验均进行3次重复，应用SPSS 17.0软件对试验数据进行显著性分析（P<0.05），Origin 8.5软件绘图。

2 結果与分析

2.1 Lm对肉桂醛的敏感性测定

Lm对肉桂醛的敏感性结果见图1。Lm经肉桂醛处理后生长受到明显的抑制作用，随着处理浓度的增大，D600 nm逐渐降低，当浓度达到150 μg/mL时，微孔中观察不到浑浊，因此肉桂醛对Lm的MIC为150 μg/mL。在无浑浊的微孔中接种50 μL培养液涂布于BHI琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，完全无细菌生长的最小浓度为300 μg/mL，即为肉桂醛对Lm的MBC。

2.2 肉桂醛对Lm细胞形态的影响

肉桂醛对Lm细胞形态的影响见图2。正常Lm呈短杆状，菌体形态饱满，细胞表面光滑。MIC浓度的肉桂醛处理后，Lm菌体细胞变长，细胞之间的界限变得模糊。MBC浓度的肉桂醛处理后，部分细胞出现变形、膨大的现象。肉桂醛作用后Lm细胞表面并未观察到明显的凹陷和穿孔。

2.3 肉桂醛对Lm细胞通透性的影响

核酸中的嘌呤和嘧啶碱基在260 nm附近有最大吸收峰，通过测定260 nm处的紫外吸光度可以反映细胞中核酸的泄漏情况[7]。从图3、图4可以看出，肉桂醛处理1 h后，Lm细胞外的葡萄糖含量明显（P<0.05）高于空白对照，处理2 h后，核酸含量也明显（P<0.05）升高，且含量随着时间和浓度的增加逐渐升高。说明肉桂醛处理导致Lm细胞的通透性增大，细胞内的物质向细胞外流失。

2.4 肉桂醛对Lm细胞蛋白的影响

肉桂醛对Lm细胞蛋白的影响见图5，对分子量在15～170 ku的Lm细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，正常Lm蛋白电泳条带完整清晰，MIC肉桂醛处理后，Lm的电泳条带明显变浅，MBC肉桂醛处理后，部分条带逐渐缺失，缺失部分为分子量在35～170 ku之间的蛋白。 结果表明 肉桂醛处理使得Lm细胞蛋白含量降低，一方面肉桂醛抑制了Lm的蛋白特别是大分子量蛋白的合成，进而导致菌体生长受阻死亡;另一方面反映出细胞膜通透性增大导致细胞内蛋白质流失到细胞外，这与“2.3”节的结果趋势一致。

2.5 Lm细胞死亡的测定

cFDA/PI双染色结果见图6，cFDA是一种渗透性染料，自身不发荧光，穿过细胞膜后被细胞内的酯酶水解，释放出发绿色荧光的羧基荧光素cF，非渗透性的cF只能保留在具有完整细胞膜的活细胞中，死细胞和细胞膜破损的受伤细胞不能被染色[8]。PI不能穿过完整的活细胞膜，只能进入受伤细胞和死细胞破损的细胞膜并与核酸结合发红色荧光，因此PI染色可以反映出细胞膜破损和细胞死亡的程度[9]。采用cFDA/PI双染色结合流式细胞仪可以检测菌体活细胞、受伤细胞和死细胞。流式细胞仪FL1-FL3散点图显示4类不同的细胞，即cFDA+/PI-的活细胞（Q1-LR）、cFDA+/PI+的受伤细胞（Q1-UR）、cFDA-/PI+的死细胞（Q1-UL）以及cFDA-/PI-的细胞碎片（Q1-LL）[10]。试验结果表明，正常Lm大多数细胞处于活细胞状态，所占比例为93.1%;MIC肉桂醛处理6 h后，活细胞比例降低到2.6%，细胞受伤率和死亡率分别升高到73.7%和21.9%，大多数细胞处于膜损伤状态，但是细胞内的酯酶仍然具有活性;MBC肉桂醛处理6 h后，细胞死亡率升高到95.6%，大多数细胞处于死亡状态。

3 结论与讨论

本试验研究了肉桂醛对Lm的抑制作用。肉桂醛对Lm的MIC和MBC分别为150、300 μg/mL。扫描电镜结果显示，肉桂醛处理后Lm出现变形、膨大的现象，细胞表面并未观察到明显的凹陷和穿孔。 肉桂醛处理1 h和2 h 后Lm细胞外的葡萄糖和核酸含量明显高于空白对照，说明肉桂醛处理使得Lm细胞通透性增大，细胞内的物质向细胞外流失。SDS-PAGE电泳分析结果表明，肉桂醛处理后Lm细胞蛋白含量降低，肉桂醛抑制了分子量在 35～170 ku之间蛋白的表达。cFDA/PI双染色结合流式细胞仪检测结果显示，肉桂醛处理后的Lm活细胞比例降低，细胞受伤率和死亡率升高，MIC浓度的肉桂醛处理6 h后，细胞受伤率升高到73.7%，MBC浓度的肉桂醛处理6 h后，细胞死亡率达到到95.6%。综上所述，肉桂醛可对Lm的细胞形态、细胞膜渗透性造成损伤，并且抑制其大分子量蛋白质的合成。有关肉桂醛抑制Lm的特异性靶标和分子机制还有待进一步研究。

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