基于近红外技术的沼液丁酸和异丁酸定量分离研究

贺 莉 ， 冉 毅 ，李冰峰

(1. 农业农村部沼气科学研究所， 成都 610041； 2. 农业农村部农业生态与资源保护总站， 北京 100125)

中国是农业大国，畜禽废弃物年排放量为134亿t，农作物秸秆年达5亿t(干重)[1]，给生态环境造成巨大压力。厌氧发酵是处理畜禽养殖粪污和农业生产废弃物的重要手段，通过水解、酸化和产甲烷3个阶段将废弃物中的有机质转化为清洁能源和植物易于吸收的有机肥。这3个阶段中，酸化阶段是制约厌氧发酵系统的关键步骤，尤为重要。一方面，厌氧发酵产气量依赖于产甲烷菌持续不断将产生的挥发性脂肪酸浓度(VFAs)转化为甲烷，另一方面，当厌氧反应器中累计VFAs浓度过高时，会抑制产甲烷菌的活跃程度甚至造成厌氧发酵体系的崩溃，因此定期监测厌氧反应器中的VFAs浓度，是掌控厌氧反应器运行状况的重要手段。目前VFAs的国际通用检测方法是高效液相色谱法(HPLC)和气象色谱法(GC)。厌氧发酵体系背景复杂，采用色谱法检测前，需要酸化、离心、过滤等预处理手段，尤其是采用GC法测定甲酸时，还需要进行衍生化处理，导致前处理过程复杂，大大增加检测时长。使用HPLC时，预处理后的上清液中依然混有醇、酸、酯、蛋白质和氨基酸等物质，均需要频繁更换保护柱，避免造成色谱柱堵塞，检测成本高；不计预处理时间，HPLC一次检测时间为25～30 min，耗时费力；尤其是分离丁酸和异丁酸这种同分异构体时，最大吸收波长相近，存在色谱峰重叠，常规C18柱无法进行准确定量，导致VFAs定量不准确。近红外(near infrared, NIR)光谱结合化学计量学是一种易于操作、低成本的快速检测方法，可替代传统实验室分析用于定性和定量分析。目前近红外被广泛用于食品[2]、农产品和药品的成分鉴定[3]，以及特色农产品产地辨别[4]。近红外光谱技术与厌氧发酵结合紧密，被用于有机废弃物生化产甲烷潜力预测[5]，实时监控挥发性脂肪酸含量[6]。目前关于NIRS法分析沼液中丁酸和异丁酸的分离研究在国内尚未见报道。本文利用近红外光谱仪扫描样本，建立快速、便捷的近红外光谱定量分析模型预测样品中丁酸和异丁酸浓度；对光谱进行波段筛选和算法优化，有效提高丁酸和异丁酸模型定量的准确度，为VFAs的准确定量提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品收集与制备

实验室用超纯水配置丁酸和异丁酸不同的浓度的单标样品和混合标准溶液样品27个，其中18个作为训练集，用于建立近红外光谱模型；9个作为测试集，用于验证模型的准确性。

1.2 光谱采集与处理

实验采用Bruker MPA多功能型傅立叶变换近红外光谱仪，带漫反射积分球附件。光谱范围780～2500 nm,扫描次数64次，分辨率为16 cm-1。在室温(20℃～22℃)环境下，将溶液倒入玻璃样品杯，每个样品分别装填3次，分别扫描后取各样品光谱的均值。

1.3 化学分析

配置的丁酸和异丁酸用于GC建立标准曲线，用外标法对混合样品中丁酸和异丁酸检测通过GC定量分析。每个样品取3个平行样测定，取平均值。

1.4 NIRS数学模型的建立方法

本研究采用偏最小二乘回归(Partial Least Square Regression, PLSR)算法对近红外光谱数据建立回归模型，利用混合样本的近红外光谱，实现对其中的丁酸、异丁酸含量的定量分析。PLSR作为经典的多元校正方法，已广泛应用于近红外光谱的定量分析中[7]，其算法的主要思想是在主成分分析的基础上，不仅对混合物的光谱量测矩阵Y进行正交分解，获取其主成分T(T = {ti}, i = 1, 2, 3, …, m)，同时还将浓度矩阵C也进行分解，得到其主成分R(R = {rj}, j = 1, 2, 3, …, p)。

Y=USVt+E=TVt+E

(1)

C=PGQt+E=RQt+E

(2)

其中E为残差。最终预测模型利用最小二乘原理，建立矩阵T和R之间的线性关系：

R=BC

(3)

其中B为回归系数矩阵。在本研究中，偏最小二乘回归的建模与预测过程，均在MATLAB(R2016b, version 9.1.0)中完成。

2 结果与讨论

2.1 丁酸和异丁酸溶液实验室化学分析结果

为准确定量丁酸和异丁酸浓度，配置丁酸和异丁酸比例从10%～90%，根据实验室检测沼液中丁酸和异丁酸的实际样品浓度，控制混标总浓度为200 mg·L-1。为准确定量配置溶液浓度，分别配置丁酸和异丁酸单标标准曲线，用外标法对配置浓度进行校正。设置序号为1,2,4,5,7,9的样品为训练集，通过其浓度测试建立PLSR 模型；将3,6,8的样品设定为测试集，用于浓度预测。溶液配置浓度比和实验预测值见表1。

表1 不同混合溶液中丁酸、异丁酸的配比

2.2 溶液样品的近红外光谱

根据表1中丁酸和异丁酸的混标，实验共设计9个样本，每个样品进行3次独立的测试，此最终获得27份混合样品，如图1所示。从图中可知，不同浓度的混标样品的平均光谱吸收峰的位置大致相同，集中在4500 nm～8000 nm，不同浓度混标的吸光值迥异。

图1 27份丁酸、异丁酸混合溶液的近红外光谱

2.3 丁酸和异丁酸的NIRS模型

将平行样本的光谱进行平均，获得各平行样本的平均光谱，随后将3，6，8号样本留作独立测试集，对PLSR模型进行检验，其余混合样本作为训练集构建PLSR模型。对于丁酸与异丁酸，笔者分别建立PLSR模型对其含量进行预测，模型采用前5个PLS潜变量进行回归建模，实验设定的丁酸、异丁酸含量与预测结果的相关性如图2和图3所示。

图2 训练集与独立测试集中丁酸实际含量与预测值比较

图3 训练集与独立测试集中异丁酸的实际含量与预测值比较

从图2和图3可以看出，测试集中的丁酸、异丁酸含量的预测值与其实际含量的相关系数(R2)均大于0.99，表明模型可以很好的对混合样本中两种挥发酸的含量进行预测。

图4和图5显示了模型的预测误差，包括均方根误差(Root Mean Square Error, RMSE)以及平均绝对百分比误差(Mean Absolute Percentage Error, MAPE)。对于测试集来说，模型在预测丁酸、异丁酸的含量时，RMSE均为3.862%，MAPE小于9%，该预测误差在厌氧发酵体系的丁酸、异丁酸含量检测中，可满足实际应用的需求。

图4 训练集与独立测试集中模型对于丁酸含量的预测误差

图5 训练集与独立测试集中模型对于异丁酸含量的预测误差

3 结论

近红外光谱技术可用于厌氧发酵体系中丁酸和异丁酸的定量分析研究，具有较好的适用性。外部验证丁酸和异丁酸浓度与近红外光谱预测值非常接近，RMSE均为3.862%，MAPE小于9%，具有良好的预测性。下一步将针对总挥发酸中每一种挥发酸建立模型，以期早日用于真实样品的测试，节省检测时间，降低检测费用。