不同品种彩粒小麦苗麦绿素提取工艺优化及其含量比较

杨文平，冯芳，郝教敏，夏清，靳明凯，杨珍平*，高志强

(1.华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063210；2.天津科技大学， 天津 300222；3.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；4.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

麦绿素(Barley Green)是从麦类植物嫩苗中获得的一种富含蛋白质、维生素、黄酮、超氧化物歧化酶(SOD)等200多种营养物质和抗氧化活性组分的最适合人体细胞需要的复合物质[1]，在世界单项资源中目前是养分含量最丰富和均衡的，具有降血糖、降血脂、抗癌、消炎、延缓衰老和抗疲劳等作用[2，3]。在日本，被认定为保健食品；在美国，被批准为食品增补剂。由此，国内外对麦绿素的研发进程明显加快，国外研制开发出麦绿素可乐、麦苗膳食纤维食品、青麦酶营养品和麦苗SOD饮料等产品；国内麦叶食品开发较晚，市场上也出现了一些麦叶相关产品，如麦绿素粉、麦苗粉等，还有麦绿素韧性饼干的研制等。我国幅员辽阔，麦类种质资源丰富；麦绿素加工过程工艺参数因原料的不同而有变化，现阶段的开发研究主要集中在大麦、青稞、荞麦上[4-6]，而对于小麦的相关研究报道甚少。彩粒小麦作为珍贵的小麦种质资源，因其具有独特的营养成分和保健功能，备受人们关注[7]。麦绿素中，蛋白质所含氨基酸丰富且易被人体吸收，特别是富含精氨酸、酪氨酸和组氨酸等人体必需的氨基酸，是一种很好的氮源；黄酮和SOD含量高，具有很强的自由基清除能力和抗氧化性能，也是目前最引人关注和研究最多的生物活性物质[8-12]。因此，本研究选择麦绿素中类黄酮、蛋白质含量和SOD酶活性3种有效成分作为评价指标，采用水提法对不同品种彩粒小麦苗，包括山农紫小麦、紫小麦204W17、黑小麦031244和黑小麦202W20的麦绿素提取工艺进行正交优化和比较，为拓宽麦绿素加工原料和深入研究加工工艺提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 原料

4个品种彩粒小麦(TriticumaestivumLinn.)，包括山农紫小麦、黑小麦031244、紫小麦204W17、黑小麦202W20。山农紫小麦和黑小麦031244由山西农业大学农学院小麦研究所提供，紫小麦204W17和黑小麦202W20由山西省农科院棉花科学研究所提供。

1.2 仪器设备及试剂

1.2.1 仪器设备

78-1型磁力搅拌器 常州润华电器有限公司；WFJ 2100型可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；LD5-2B型低速离心机 北京雷勃尔医疗器械有限公司；电子天平 上海精密科学仪器有限公司；BCD-252KSF型冰箱 青岛海尔股份有限公司。

1.2.2 试剂

3%～4% H2O2溶液，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，4% NaOH溶液，无水乙醇，pH 7.8磷酸缓冲液(磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制)，1.3×10-2mol/L Met(甲硫氨酸)溶液，7.5×10-4mol/L NBT(氯化硝基四氮唑蓝)，2×10-5mol/L VB2，10-4mol/L EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)溶液，牛血清蛋白，考马斯亮蓝G-250。上述试剂均为分析纯配制。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

取洗净、晾干的培养皿，在其内铺两层滤纸并润湿。随机取约100粒彩粒小麦种子平铺在滤纸上，加水至刚没过种子。于室温下培养4～5 d，移植花盆中培养。割取生长至15 cm左右的彩粒小麦苗，剔除杂质和黄叶后，用3%～4% H2O2溶液浸泡20 min，之后用蒸馏水冲洗干净，待水分晾干后备用。

1.3.2 麦绿素的提取

采用水浸提法，称取一定量经过预处理的小麦苗于研钵中→按一定的料液比进行研磨→于小烧杯中在一定温度下搅拌一定时间→于漏斗中过滤，制得滤液待用。

1.3.3 麦绿素中有效成分测定

本研究通过测定类黄酮、蛋白质含量以及SOD酶活性来评价麦绿素的提取工艺。

类黄酮含量的测定采用硝酸铝比色法[13]。取3 mL滤液于10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL亚硝酸钠、0.5 mL硝酸铝和4 mL氢氧化钠，用乙醇定容，测定吸光度。类黄酮标准曲线方程：y=19.208x-0.0049，y为吸光度，x为待测液浓度。

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法[14]。移取2 mL滤液，加蒸馏水至10 mL，取混合液1 mL与5 mL考马斯亮蓝反应，测其吸光度。蛋白质标准曲线方程：y=0.7407x+0.025，y为吸光度，x为待测液浓度。

SOD活性的测定采用NBT光还原法[15]。取3 mL滤液，加5 mL磷酸缓冲液，离心；取上清液0.1 mL，依次加1.5 mL磷酸缓冲液，0.3 mL Met，0.3 mL NBT，0.3 mL VB2，0.3 mL EDTA，0.2 mL蒸馏水，光照后测吸光度。

计算公式：SOD总活力(U/100 g)=(Ack-Ae)×V/(Ack×0.5×W×Vt)。

式中：Ack为对照管的吸光度；Ae为样品管的吸光度；V为样品液总体积(mL)；Vt为测定时样品用量(mL)；W为样品鲜重(g)。

1.3.4 彩粒小麦苗麦绿素提取工艺的正交试验设计

采用L9(34)正交试验设计。选取对提取麦绿素影响最大的3个单因素：浸提温度、浸提时间和料液比，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 数理统计与分析方法

对所得数据用Excel数理统计分析软件整理制表，并进行LSD极差分析与LSR多重比较。用Sigma Plot 10.0软件对试验结果进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种彩粒小麦苗麦绿素中类黄酮含量比较

表2 类黄酮含量的正交试验结果Table 2 Orthogonal test results for the content of flavonoids mg/100 g

续 表

注：同列大写字母不同，表示三水平差异极显著(P<0.01)；同列小写字母不同，表示三水平差异显著(P<0.05)，表4和表6同。

由表2正交试验结果可知，在实测9组中，山农紫小麦、黑小麦031244和黑小麦202W20的提取麦绿素中类黄酮的最佳工艺组合都是A1B3C3，类黄酮含量均在27 mg/100 g以上；紫小麦204W17的最佳工艺组合是A2B2C3，类黄酮含量达到40 mg/100 g以上。由LSR最小极差分析可知，浸提温度(A)、浸提时间(B)和浸提料液比(C)3个因素对4个品种麦绿素中类黄酮含量的影响次序不同，其中对山农紫小麦和黑小麦031244的影响次序是A>C>B，对紫小麦204W17和黑小麦202W20的影响次序是C>A>B。SSR方差分析(见表3)表明，浸提温度对4个品种麦绿素中类黄酮含量的影响均达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平，浸提料液比对3个品种(山农紫小麦除外)麦绿素中类黄酮含量的影响均达到显著(P<0.05)水平，浸提时间对4个品种麦绿素中类黄酮含量的影响均不显著(P>0.05)。基于麦绿素中类黄酮含量，4种彩粒小麦苗提取麦绿素优选后的最优工艺组合依次是：A1B3C3、A2B2C3、A1B3C3、A1B2C3。进一步验证优选组合与实测组合，结果表明：山农紫小麦、黑小麦031244、黑小麦202W20提取麦绿素的最优工艺皆为A1B3C3，类黄酮含量分别为27.81，27.92，27.18 mg/100 g；紫小麦204W17的最佳工艺是A2B2C3，类黄酮含量为40.21 mg/100 g。

比较上述两种最优工艺组合，后者的温度较高，说明在一定的范围内，较高温度有利于破坏植物细胞壁，缩短浸提时间，有利于类黄酮向水溶剂充分地扩散，从而提高类黄酮得率。这4种彩粒小麦苗中紫小麦204W17的类黄酮含量最高，由于类黄酮为次生代谢产物，是在体内经代谢途径生成的，由此可推断紫小麦204W17代谢途径更为旺盛，若想制得富含类黄酮的麦绿素保健产品应选取该品种。

注：“*”为P<0.05；“**”为P<0.01，表5和表7同。

2.2 不同品种彩粒小麦苗麦绿素中蛋白质含量比较

表4 蛋白质含量的正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of the content of protein %

续 表

由表4正交试验结果可知，在实测9组中，山农紫小麦、黑小麦031244和黑小麦202W20的提取麦绿素中蛋白质的最佳工艺组合都是A1B3C3，蛋白质含量分别为47.70%、33.54%和38.19%；紫小麦204W17的最佳工艺组合是A2B2C3，蛋白质含量达到49.07%。由LSR最小极差分析可知，浸提温度(A)、浸提时间(B)和浸提料液比(C)3个因素对4个品种彩粒小麦苗麦绿素中蛋白质含量的影响次序不同，其中对山农紫小麦和黑小麦031244的影响次序是A>C>B，对紫小麦204W17和黑小麦202W20的影响次序是C>A>B。SSR方差分析(见表5)表明，浸提温度对4个品种彩粒小麦苗麦绿素中蛋白质含量的影响均达到显著(P<0.05)水平，浸提料液比对紫小麦204W17和黑小麦202W20 2个品种麦绿素中蛋白质含量的影响达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平，浸提时间对4个品种麦绿素中蛋白质含量的影响均未达到显著水平(P>0.05)。基于麦绿素中蛋白质含量，4个品种彩粒小麦苗提取麦绿素优选后的最优工艺组合依次是：A1B3C3、A2B2C3、A2B3C3、A1B3C3。经验证，山农紫小麦和黑小麦202W20提取麦绿素中蛋白质的最优工艺均为A1B3C3，蛋白质含量分别是47.72%和38.18%；黑小麦031244提取麦绿素中蛋白质的最优工艺是A2B3C3，蛋白质含量是33.95%；紫小麦204W17提取麦绿素中蛋白质的最优工艺是A2B2C3，蛋白质含量是49.04%。

以蛋白质为指标，4个品种彩粒小麦苗的麦绿素最佳提取工艺都不尽相同。可能是因为蛋白质不像类黄酮物质一样仅存在于胞基质中，它还分布在细胞膜上，而4个品种彩粒小麦苗细胞结构有所不同，所以蛋白质的提取量更易受到温度、提取时间以及料液比的影响。其次，在测定蛋白质含量时，也受到环境温度的影响。温度的高低决定着染液蛋白质复合物的形成速度，并随着试剂温度的升高，复合物吸光值也会增加。再者，由于考马斯亮蓝染液有两种不同颜色形式的光谱重叠，随着更多的染液和蛋白质结合，试剂的背景值不断地减少，这些因素都会引起蛋白质含量的差异以及工艺的不同。

表5 蛋白质含量的方差分析Table 5 Analysis of variance of the content of protein

2.3 不同品种彩粒小麦苗麦绿素中SOD酶活性比较

表6 SOD酶活性的正交试验结果Table 6 Orthogonal test results of SOD activity U/100 g

续 表

由表6正交试验结果可知，在实测9组中，4个品种彩粒小麦苗提取麦绿素中SOD酶活性的最佳工艺组合都是A3B3C2，SOD酶活性范围在1103～1867 U/100 g之间。由LSR最小极差分析可知，浸提温度(A)、浸提时间(B)和浸提料液比(C)3个因素对4个品种彩粒小麦苗麦绿素中SOD酶活性的影响次序相同，均是A>B>C。经SSR方差分析(见表7)表明，浸提温度对4个品种彩粒小麦苗麦绿素中SOD活性的影响均达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平，浸提时间对山农紫小麦和紫小麦204W17 2个品种麦绿素中SOD活性的影响达到显著(P<0.05)水平，浸提料液比对4个品种小麦苗麦绿素中SOD活性的影响均不显著(P>0.05)。基于麦绿素中SOD酶活性，4个品种彩粒小麦苗提取麦绿素优选后的最优工艺组合依次是：A3B3C2、A3B1C2、A3B3C3、A3B2C1。经验证，4个品种彩粒小麦苗提取麦绿素中SOD酶活性的最优工艺均为A3B3C2，SOD酶活性依次是1865.3，1106.4，1250.7，1640.1 U/100 g。本研究中山农紫小麦苗麦绿素中SOD含量最高，若要制备SOD可考虑选择从该小麦苗中提取。

表7 SOD酶活性的方差分析Table 7 Analysis of variance of SOD activity

2.4 不同品种彩粒小麦苗的麦绿素含量评价

基于类黄酮、蛋白质含量和SOD酶活性，为了便于比较4个品种彩粒小麦苗的麦绿素含量，将优选后的不同品种彩粒小麦苗麦绿素提取工艺汇总，见表8。并依据公式评价指数=C蛋白质+C类黄酮+CSOD/100，计算出4个品种彩粒小麦苗的麦绿素含量评价指数，见表8。结果表明，两种紫小麦的麦绿素含量更高。

表8 4个品种彩粒小麦苗的麦绿素含量评价Table 8 Evaluation of barley green content of four varieties of color-grained wheat seedlings

3 结论

基于麦绿素中类黄酮、蛋白质含量和SOD酶活性，采用水浸提法和正交试验对不同品种彩粒小麦苗麦绿素提取工艺进行优化并做含量比较，结果表明，紫小麦204W17苗麦绿素中类黄酮和蛋白质含量均最高，分别为40.21 mg/100 g和49.04%，其提取的最佳工艺条件为浸提温度25 ℃，浸提时间2.0 h，浸提料液比1∶4；山农紫小麦苗麦绿素中SOD含量最高，为1865.3 U/100 g，其提取的最佳工艺条件为浸提温度30 ℃，浸提时间2.5 h，浸提料液比1∶3。综合评价得出紫小麦204W17苗和山农紫小麦苗的麦绿素含量更高。